荧光光谱用于光动力疗法中光敏剂光漂白特性研究

荧光光谱用于光动力疗法中光敏剂光漂白特性研究 荧光光谱用于光动力疗法中光敏剂光漂白 特性研究 第27卷,第10F 2007年10月 光谱学与光谱 A 分 nal 析v0l?27'No.10,pp S 2O73—2O78 pectroscopyandSpectralalysisOctober,2007 荧光光谱用于光动力疗法中光敏剂光漂白特性研究 王雷,顾瑛,李晓松,刘凡光,于常青 1.中国人民解放军总医院激光医学科,北京100853 2.北京理工大学光电系,北京100081 摘要应用荧光光谱技术研究溶液中血卟啉单甲醚(HMME)的光漂白与光产物生成.以532D.In倍频 Nd:YAG激光器照射样品,功率密度为100rnW?cm-,以光学多通道分析仪(OMA)采集荧光光谱.照光 过程与荧光光谱采集同步进行.通过构建基本光谱与最/b----乘拟合,由单条实测光谱中分解求得HMME荧 光(613rim),光产物荧光(639nm)及自体荧光的强度.HMME初始浓度不超过1Op-g?mL时符合荧光一浓 度线性函数关系.对照光过程的荧光光谱监测同时观察到HMME漂白,光产物生成与漂白,以及样品光学 特性变化引起的自体荧光强度起伏.光产物漂白后的二次产物引起样品光学特性 显着改变.所建立的荧光 光谱探测系统与光谱分析方法可满足光敏剂漂白特性体外研究的需要,并为光动 力治疗的剂量学在体监测 提供有效研究方法. 关键词光动力疗法;剂量学;荧光光谱;光漂白;光产物;血卟啉单甲醚 中图分类号:R318.5文献标识码:A文章编号:1000—0593(2007)10—2073—06 引言 光动力疗法(PDT)中,当前临床使用的大多数光敏剂均 遵循单线态氧(02)Or导的Type-II型光动力作用机制.02 除对靶组织细胞产生光动力杀伤外,还使光敏剂分子发生自 敏光氧化反应,造成其不可逆的光漂白,导致具有光化学活 性的光敏剂浓度及单线态氧的生成速率降低.早期研究认 为,光敏剂的光漂白会降低PDT治疗效率,但同时又可保护 正常组织免受光动力损伤[1]. 直接影响PDT治疗效果的一个关键问,是治疗剂量 的精确量化与实时定量剂量学方法的建立.近年来的研究发 现,02介导的光敏剂光漂白与'02对靶组织的杀伤作用机 制相同,所受到的各种影响因素也相同,光敏剂光漂白可用 来综合衡量02对靶组织的光动力作用剂量L2].PDT过程 中,对光敏剂光漂白的在体荧光监测有望成为一种"隐性"的 实时剂量学方法r4_6=.光敏剂光漂白后光产物的生成机制同 样为02所介导,而且光产物本身可能也具有光动力活性, 对PDT治疗剂量产生影响L7]..因此,对光敏剂光漂白与光产 物生成的荧光光谱监测已成为近年来PDT剂量学研究的热 点问题"].在PDT治疗中靶组织的荧光发射光谱中,光产 物与光敏剂的荧光光谱互相重叠;治疗过程中,由于血流变 化等因素导致的组织光学特性改变,使得自体荧光强度也可 能相应发生变化[1,这些都对采用新型光谱分析方法提出 了要求. 血卟啉单甲醚(HIV~VIE)是一种有代性的国产新型第 二代光敏剂,具有化学组分单一,性质稳定,单线态氧产率 高,组织清除迅速,避光期短等优点E13-15],已被我们成功应 用于鲜红斑痣等良性疾病的PDT治疗,其荧光光谱特性及 在光动力诊断(PDD)中的应用前景也受到国内研究者的关 注口州引.近来,吴云霞口如等曾用血卟啉衍生物作为肿瘤的光 动力诊断.本文对溶液环境中HMME的光漂白与光产物生 成进行了荧光光谱研究. 1材料与方法 1.1光敏剂 HMME(由第二军医大学五二三药物研究室提供),原 液浓度为10mg?mL_..在暗室条件下,用0.9生理盐水 稀释原液,配制成所需浓度的溶液样品,盛装于小号透明塑 料试管内. 1.2激光照射与荧光激发 采用倍频Nd:YAG准连续激光器(由天津医科大学生物 医学工程系提供),输出波长532rln2,脉冲频率1kHz,脉宽 收稿日期:2006—05—06.修订日期:2006-08—08 基金项目:北京市自然科学基金(3072012)资助 作者简介:王雷,1977年生,中国人民解放军总医院激光医学科博士后*通讯联系人 e-mail:yinggu@yahoo.COITI 2074光谱学与光谱分析第27卷 25ns,通过光纤与扩束头输出.此光源兼有激光照射与荧光 激发功能,荧光光谱采集与照光过程同步进行.照射光斑直 径3cm,功率密度100mW?cm一.HMME溶液样品通过 试管架放于照射光斑内的固定位置. 1.3荧光光谱采集 应用光学多通道分析仪(OMA)采集荧光光谱,其主要 组成部分为MS257型光谱仪(美国Oriel公司产)与Insta— SpecTMV型ICCD(英国Andor公司产).光谱仪的探测波长 范围设为约59O,735nm,光谱分辨率约为0.37nm.入射 狭缝后放置红色长波通滤光片,用以阻挡杂散激发光.荧光 采集光纤束由13根芯径100m光纤组成,在样品近端呈圆 形排列,紧贴固定于样品试管侧面;在样品远端呈直线排 列,通过耦合透镜与光谱仪入射狭缝相连.ICCD置于光谱 仪的出射焦平面,其内部集成微通道板型第二代像增强器, ×578,采 与像敏面阵采用光纤耦合.像敏面阵像素数为385集光谱时工作于线阵模式,即将纵向578个像素进行合并. 接收到的荧光信号经控制卡进行16位A/D转换后,输入并 存储在计算机中供后续处理.ICCD单次开门时间设为25 ms,并积分2O次. 1.4荧光光谱分析 HMME溶液在照光过程中的荧光光谱主要由以下三部 分构成:HMME荧光,光产物荧光及自体荧光背景.三种荧 光的基本光谱构建方法如下. (1)选配不含HMME的生理盐水溶液,采集其荧光光谱 并相对峰值作归一化,获得自体荧光背景的基本光谱(见 图1). O 600640680 Wavelength/nm Fig.1Autofluorescencebasisspectra beforeandafteraddingfilter 图1中显示,由于滤光片的滤光作用,使自体荧光光谱 形状发生改变,形成621nm处的平缓谱峰.图1中的三条曲 线之间并非简单的乘法关系,这是由于:加入滤光片前,自 体荧光背景来源于样品及光纤;加入滤光片后的实测自体荧 光光谱中,除主要成分为透过滤光片的原有自体荧光外,还 包含滤光片本身受杂散激发光照射后的少量自体荧光. (2)选配浓度为1Og?mI的HMME溶液,在照光过 程中所采集的典型荧光光谱具有613,639,674nm三个特 征峰(见图2).将其扣减一定的自体荧光背景后进行Lorent— zian光谱拟合.拟合结果中,613与674am的两个Lorentzi— an峰来自光敏剂的荧光发射;639nrn的Lorentzian峰代表 光产物的荧光发射,将其相对峰值作归一化即得光产物荧光 的基本光谱.选择在照光开始前采集的荧光光谱,扣减一定 的自体荧光背景并相对峰值作归一化,作为HMME荧光的 基本光谱. 6OO640680720 Wavelen$th/nm Fig.2Constructionofphotoproductbasis spectrausingLorentzianfitting 构建好的三种荧光基本光谱见图3.对于每条实测荧光 光谱F一(),可表达为这三种基本光谱的线性叠加,如下 式 Fr0I()一jPS1,()+IPPfPP()+jAF() 其中,(),/pp(i),,AF()分别为HMME荧光,光产物 荧光与自体荧光背景的基本光谱.将构建好的基本光谱代入 上式,并作最小二乘拟合,即可求得三种荧光各自的强度值 IFs,jPP,j^F. 0.8 0.6 藿 主 O 64O680 Wavelength/nm Fig.3BasisfluorescencespectraofHMME solutionusedforleast-squaresfitting 2实验结果 2.1HMME荧光一浓度关系 选配l1种不同浓度的HMME溶液样品,浓度依次为 2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20g?mL-.在相同的荧 l8642O OOOO 占Isll苫Iaullu?0rIzl声宣0Z mI兽lII0??0 0一sI皇工]?0u?0筝蜀口矗商巨0 第1O期光谱学与光谱分析2075 光激发与探测条件下,分别对其进行单次照光激发,并采集 荧光光谱[见图4(a)].对所测光谱数据进行拟合,获得照光 初始时刻溶液样品中HMME荧光,光产物荧光及自体荧光 背景各自的强度值[见图4(b)].其中,HMME荧光强度与 浓度间关系曲线的低浓度(<1OtLg?mL)部分见图5. 64O鹤O Wavelength/nm 051O152O Concentration/(gg?mL-1) Fig.4Least-squaresfittingforfluorescencespectraofH^傀 solutionwithdifferentinitialconcentration(pre-irradia- tion) (a):Originalspectra;(b):Fittingresults O246810 ) Concentration/(gg?mL一 Fig.5HMMEfluorescenceintensityasafunction ofconcentration(~10?mL) 2.2HMME光漂白监测 选配浓度为1Og?mL1的HMME溶液样品,对其进 行激光照射,并同步采集荧光光谱.照光时间为90min,在 功率密度100n1w?cm-.下,能量密度达540J?cm-.对所 测光谱数据进行拟合,并将拟合结果均相对于初始时刻的 HMME荧光强度作归一化,相对于照光能量密度绘制 HMME光漂白曲线,光产物生成曲线及自体荧光变化曲线, 结果见图6.在照光过程的前半段,选取7个能量密度点,即 0,30,60,90,120,180,240J?cm,其所对应的荧光光 谱见图7;在照光过程的后半段,选取5个能量密度点,即 306,354,420,480,540J?cm_.,其所对应的荧光光谱见 图8. 鲁1 害 量0.8 昌 ?0.6 器 ?o.4口 鲁o.2 矗 0n 64068072o Wavelength/nm 64O鹤O Wavelength/rim Fig.7FluorescencespectraofH^傀solution duringthefirst-halfofirradiation (a):Originalspectra;(b);Normalizedspectra 3讨论 当光敏剂的荧光强度与浓度呈线性函数关系时,光敏剂 的荧光强度变化才能准确描述其浓度变化.因此,首先有必 9876543210 .Ilj鲁su苫ul1u?aJ0Il岳 8642O .I1.茸su备ul1J0Il岳 87654321O .Ill盥l?lI3IIul1u?J0Il岳 18642O OOOO ?l1苫uu?.10IIU—BI1_L10Z 654321O . ?Isl1后u0?0岳 2076光谱学与光谱分析第27卷 要对HMME荧光强度与其浓度之间的对应关系进行研究. 结果显示. 3 2.5 2 ll5 0.5 0 640680 Wavelength/nm 600640680720 Wavelen~h/nm Fig.8FluorescencespectraofHMMEsolution duringthesecond-h~fofirradiation (a)!Originalspectra;(b):Normalizedspectra (1)在所选浓度范围内,HMME荧光强度随浓度升高而 递增的关系符合二项式函数[见图4(b)].此种递增关系在浓 度较低时(<10Fg?mL)可视为线性(见图5),而在浓度 较高时趋于平缓的非线性递增.这是由于高浓度HMME分 子之间的聚集作用会降低其荧光量子产率.如果浓度过高, 甚至会产生荧光淬灭.因此,对HMME溶液样品进行光漂 白监测实验时,初始浓度值应在满足荧光一浓度线性关系的 浓度范围内,此时HMME的荧光衰减过程才能够准确反映 其光漂白过程. (2)自体荧光背景强度随着HMME浓度增大而呈平缓 的线性升高[见图4(b)].这是由于,系统所探测到的自体荧 光背景主要来自光纤探头本身及其邻近微小区域内的试管壁 及生理盐水.随着HMME浓度增大,溶液的光学特性由透 明趋于浑浊,自体荧光受到HMME分子更多的反射与散 射,进入光谱仪的信号增强.因此,自体荧光背景强度随时 间的改变可以反映样品光学特性的动态变化.图4(b)同时显 示,对于不同浓度的HMME溶液样品,其照光前的荧光光 谱中,含有不同强度的自体荧光背景,采用统一扣减相同自 体荧光背景的简单方法不可行,证明了采用光谱拟合方法的 必要性. (3)各浓度下,光产物的荧光强度值均低至接近于0[见 图4(b)].这说明由于各荧光光谱均采集于样品首次受光照 激发的初始状态,此时HMME光漂白与光产物生成可忽略 不计,光产物对荧光光谱的贡献很小. 关于此套荧光光谱采集系统与光谱拟合方法的应用,采 用一组HMME溶液光漂白监测实验的典型结果来说明.图 7与图8显示,在照光过程中HMME溶液样品的荧光发射 光谱中,HMME与光产物的荧光光谱互相交叉重叠,并均 叠加在自体荧光背景之上,且各自荧光强度均随照光时间呈 动态变化.我们根据各荧光成分的基本光谱,通过光谱拟合 方法,从实测荧光光谱数据中分解提取出HMME荧光衰 减,光产物荧光强度变化与自体荧光强度起伏等三方面信息 (见图6). 图6显示,HMME荧光衰减所揭示出的光漂白过程相 对于能量密度呈指数衰减曲线,其漂白速率在低能量密度时 为最高,并随能量密度增大而逐渐降低;低能量密度时,光 产物含量由初始时刻的接近于0开始显着增高,并在能量密 度约为140J?cm-.时达到最大值,之后随能量密度增大而 呈平缓下降,说明其在不断生成的同时自身也会发生漂白, 其含量变化是生成与漂白过程的综合结果;在照光过程的前 半段,自体荧光背景强度起伏很小,稳定在HMME初始荧 光强度的0.16倍左右,而在照光过程的后半段,自体荧光背 景强度呈接近于线性的持续增强,到照光结束时增至 HMME初始荧光强度的约0.45倍.需要指出的是,图6所 示光产物的相对荧光强度变化曲线虽然可以准确描述其生成 过程,但并不代表其相对于初始时刻HMME的实际浓度水 平,这是因为光产物与HMME在激发波长处的吸收截面与 荧光量子产率均不同. 图7与图8中的荧光光谱对图6中的光谱拟合定量结果 作了定性展示.在照光过程的前半段(见图7),随着照光过 程的持续,HMME在613与674rUTI处的荧光特征峰强度下 降,且在639rUTI处出现新荧光峰并持续增强,显示HMME 不断漂白,并伴随有新光产物的生成及漂白;在光谱两侧边 缘处荧光强度的小幅下降,是HMME荧光下降与光产物荧 光增强的叠加结果,自体荧光背景强度基本稳定,说明光产 物对自体荧光的反射与散射特性与HMME相近,HMME 向光产物的物质转化对溶液光学特性影响很小. 与之形成对比的是,在照光过程的后半段(见图8),随 着照光时间延长,所测光谱的三个荧光特征峰强度均下降, 说明HMME在持续漂白,光产物的生成减少,漂白开始占 主导;三个荧光峰两侧的荧光强度出现与荧光峰相反的显着 增强趋势,说明自体荧光背景强度明显升高.定量拟合结果 显示(见图6),在40rain的照光时间内(能量密度点1,5)自 体荧光背景强度呈单调线性的持续稳定升高.可以推测,随 着HMME与光产物的进一步漂白,溶液中光产物漂白后生 成的二次产物逐渐增多,其对自体荧光背景具有强反射与散 射作用,光产物向二次产物的物质转化使溶液光学特性明显 改变.同时,在所测荧光光谱中没有出现新的荧光特征峰, 说明此二次产物的荧光特性大幅降低.由于在照光过程的前 半段自体荧光背景强度较低,稳定在HMME荧光强度的 16左右,在照光过程后半段二次产物生成对自体荧光背景 罩.内,lJIsu?lJ—?u?u?,dJ0罩T_ l86420 O000 占一生【au?,0罩口?一肖毒0Z 第1O期光谱学与光谱分析2077 的抬高作用比较显着.因此,在良好的暗室条件下获得低的 初始自体荧光背景,不但可减小其对HMME与光产物荧光 的干扰,还有利于更加突出其自身携带的光产物漂白与二次 产物生成的信息.有关HMME的光产物及其二次产物的确 定种类与理化特性,以及它们在HMME介导PDT的剂量学 中所起的作用,还需结合高压液相色谱等化学分析手段作深 入研究. 实验结果显示[见图4(a)],各浓度下所测的HMME荧 光光谱均具有比较鲜明的形状特征;如图4(b)的各浓度下, HMME荧光强度均显着高于自体荧光背景强度(约为4, 5.5倍).如果改进暗室实验条件,还可进一步降低背景强 度.这说明532nnl绿光虽然对HMME的荧光激发效率与 紫或紫外光相比不是最高,但仍具有相当的荧光激发能力, 结合超高灵敏度ICCD的使用,可以实现HMME的微弱荧 光探测. 此外,实测光谱的荧光主峰能够较好地保持近似于原始 图4(a),图7],也与滤光片的使用有关. 线型的光谱形状[见 图1显示,当不使用滤光片时,自体荧光背景光谱为探测窗 口外短波长处的自体荧光峰向长波长一侧的单调下降延拓; 当加入滤光片后,其作用除阻挡杂散激发光外,还使自体荧 光背景的光谱形状发生改变,减轻其对HMME荧光光谱主 峰两侧的不对称抬高,从而减小了实测荧光光谱的畸变程 度.与此同时,滤光片的加入还可显着滤去自体荧光背景在 短波长一侧的强度最高部分,同时对HMME在613nnl处 的荧光发射主峰透过率达84,不影响对HMME荧光的有 效探测.因此滤光片的使用有利于降低自体荧光背景强度, 突出HMME荧光信息. 当前,我们在鲜红斑痣的HMME-PDT临床实践中以 532nnl绿光作为治疗光源.其与红光相比,对HMME光动 力效应的激发效率高,并且在皮肤组织内的穿透深度适中, 在损伤浅层病变微血管靶区的同时,有利于保护深层正常血 管组织,达到良好的组织选择性治疗效果.因此,在HMME 光漂白特性研究中以532nnl绿光作为照射光源,具有临床 针对性和实际应用意义. 在对溶液样品进行光敏剂光漂白特性研究时,如果采用 荧光分光光度计与所需激光照射光源相结合的常规技术平 台,荧光激发采集与激光照射交替进行,照光过程中断频繁 (据文献报道,PDT照光中断会改变样品中的氧含量),且样 品需在两种仪器间来回移放,不但操作繁琐,还对实验结果 影响很大.我们所建立的荧光光谱采集系统采用高探测灵敏 度,高光谱分辨率OMA系统作为荧光光谱采集装置,并以 532nnl绿光作为单一光源,使其在用于激光照射的同时还 兼有荧光激发功能,而不使用独立的紫光或紫外荧光激发光 源.此方法除可以简化系统,方便操作,降低成本外,还具 有以下优点:在激发荧光时不引入额外光剂量,也不必中断 照光过程,从而不会影响光漂白特性的实验结果和光动力作 用效果,因此可以任意缩小光谱采集的时间间隔.激光照射 与荧光光谱采集同步原位进行,互不干扰,实现照光过程中 样品荧光光谱的"在线"式动态监测.特别是以后将此系统应 用于对鲜红斑痣PDT临床治疗的剂量学在体荧光监测时, 在能够随时探测荧光光谱的同时,既不干扰和中断正常的治 疗过程,又可避免紫外激发光对病人频繁照射的副作用. 4结论 将荧光光谱技术用于对溶液环境中HMME光漂白特性 的研究.532nnl绿光兼作激光照射与荧光激发光源,能够有 效激发HMME荧光,满足探测需要,同时可使照光过程与 荧光激发采集同步进行,互不影响.通过构建受光照时 HMME溶液的基本荧光光谱,并据此采用光谱拟合方法, 可由实测荧光光谱中分解求得HMME荧光,光产物荧光及 自体荧光强度. 对HMME荧光一浓度关系的研究证明,浓度不超过2O g?rnL时,HMME荧光强度相对于浓度呈二项式递增关 系,当浓度低于1Og?rnL.时可视为满足荧光一浓度线性 递增关系,溶液样品中HMME的初始浓度应位于此区间. 对HMME溶液的光漂白监测实验,通过对实测光谱的拟合 分析,可获得以下三方面信息:HMME荧光衰减反映其漂 白过程;光产物荧光强度变化反映其生成与漂白;自体荧光 背景强度起伏反映样品光学特性的变化,照光过程后期自体 荧光背景强度的升高源自于光产物漂白后的二次产物生成. 本文所建立的荧光光谱监测系统与光谱分析方法,既可 作为体外研究光敏剂光漂白与光产物生成特性的有效技术手 段,又为进一步的工作将其用于鲜红斑痣PDT治疗剂量学 的临床在体研究奠定基础. 参考文献 r1]BoyleDG,PotterWR.PhotochermPhotobio1.,1987,46:997. 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FluorescenceSpectroscopyStudyonPh0t0bleachingPropertiesof PhotosensitizersinPhotodynamicTherapy WANGLei,GUYing?,LIXiao-song,LIUFamgu~ng,YUChang-qing2 1.DepartmentofLaserMedieine,ChinesePLAGeneralHospital,Bering100853,China 2.DepartmentofOpticalEngineering,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China AbstractThephotobleaehingandformationofphotoproduetofhematoporphyrinmonomethylether(HMME)wasinvestigated insolutionbyfluorescencespectroscopy.Irradiationwasperformedby532nn3.doublfrequencyNd:YAGlaserataflueneerate of100n1W?cm.meanwhilethecollectionoffluorescencespectrawasimplementedanbyopticalmulti—channelanalyzer (()MA).Utilizingthebasisspectraconstructedandleast-squarefitting,theintensityofHMMEfluorescence(613nm),photo— productfluorescence(639rim)andautofluoreseeneecanberesolvedrespectivelyfromthesinglemeasuredspectrum.Theeorre— lationbetweenfluorescenceintensityandtheconcentrationofHMMEisconsistentwithlinea rfunctionatconcentrationsnot exceeding10/zg?mL.Monitoringthefluorescencespectroscopyduringirradiation,threekindsofinformationwereobtained, includingphotobleaehingofHMME,formationandbleachingofphotoproduet,aswellasvariationtofluorescenceintensitydue tothechangeofsampleopticalproperties.Productgeneratedbybleachingofphotoproductcausessignificantinsampleoptical properties.Theimplementationoffluorescencespectroscopymeasurementandspectralanalysismethodpresentedherecanbe utilizedeffectivelyforbothexvivoinvestigationofphotobleaehingcharacteristicsofphotosensitizerandinvivomonitoringfor dosimetryinphotodynamietherapy. KeywordsPhotodynamietherapy;Dosimetry;Fluorescencespeeroscopy;Photobleaching;Photoproduct;Hematoporphyrin monomethylether *Correspondingauthor (ReceivedMay6,2006;acceptedAug.8,2006) 阳刀 口口口口口口