IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响 IPTG诱导浓度、时间对Asia?型口蹄疫病 毒VP1蛋白表达的影响 中国畜牧兽医2O09年第36卷第5期生物技术?63? IPTG诱导浓度,时间对AsiaI型口蹄疫病毒 VP1蛋白表达的影响 魏婕,易忠,魏玉荣,王海烽,胡尔玛西,符子华,冉多良 (1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐83O052;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐83OO.O) 摘要:将口蹄疫病毒1基因插入原核表达载体pET一28a中,转化至大肠杆菌BI21.用不同的IPTG浓度与不同诱导 时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件.结果表明, 在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大}而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增 大.最后确定当IPTG浓度为3mmoi/I,诱导表达到最长时间9h时,VP1蛋白表达量最大. 关键词:口蹄疫病毒;AsiaI型;VP1蛋白;表达;IPTG;诱导浓度;诱导时间 中图分类号:S852.659.6文献标识码:A文章编号:1671—7236(2OO9)O5一OO63一O3 口蹄疫(foot—and—mouthdisease,FMD)是由口 蹄疫病毒(foot—and—mouthdiseasevirus,FMDV) 引起的偶蹄动物易感的一种急性,热性,高度接触 性,烈性传染病.FMDV由VP1,VP2,VP3和VP4 4种衣壳蛋白包裹单股正链RNA组成无包膜的正 十二面体结构,其中VP1蛋白包含主要的免疫原性 部分,分别为位于第141,160位,2OO,213位和21 , 44位的氨基酸(wild等,1969).FMDV结构蛋 白VP1暴露在病毒粒子的表面,是诱导产生中和抗 体的主要成分,它在免疫反应中发挥着重要作用,是 主要的抗原位点,因而备受研究者的关注,尤其在基 因疫苗的研制中成为研究的热点(Mateu, 1955;Gurumurthy等,2O02). 笔者构建了1基因的表达载体pET28a— VP1,通过转化大肠杆菌BL21,研究诱导剂异丙基 硫代—I)_半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导时间对VP1 蛋白表达的影响,从而寻找适宜的IPTG诱导浓度 及诱导时间,获得大量的VP1目的蛋白,为口蹄疫 的诊断和疫苗的研制提供研究基础. l材料与 1.1毒株,菌株与载体AsiaI型口蹄疫病毒KZ/ 03株重组质粒pGEMT—VP1为笔者实验室构建,保 存,大肠杆菌BL21,pET一28a表达载体由笔者实验 室保存.pGEM—T—Easy载体购自Promega公司. 1.2引物根据已测过序的重组质粒pGEMT一 收稿日期:2OO8一O9—27, 作者简介:魏婕(1983一),女,新疆人,硕士生,主要从事分子病 毒学研究. 通信作者:符子华.mail:zIhuId_f@yah00.c.m.cn VP1为参考序列一对引物:上游引物P1,5 GGATCCACCACCACTACCGGCGAGT一3;下游 引物P2,5一AAGCTTCAAAGTTCACCATCTGC— TTTTCAG一3.引物P1和P2的5端分别插入了 B&HI和Hd?酶切位点,预期扩增片段大小为 652bp. 1.3主要试剂LAT&qDNA聚合酶,dNTP,核 酸Marker及蛋白质Marker购自大连TaKaRa公 司;质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒,T4DNA连接 酶购自Promega公司.IPTG,LB粉购自上海生物 工程有限公司.辣根酶标记兔抗牛IgG购自北京 博奥森生物技术公司. 1.41基因的克隆 1.4.1目的片段的PCR扩增反应体系共50 L:上,下游引物P1,P2分别为1L,1Ommol/L dNTP1L,1O×LAT&qBufffer工5L,LATq 0.8L,pGEMT—VP1模板0.5L,补水至50L. PCR反应程序:94?5min;94?40s,59?45s, 72?60s,28个循环;72?1Omin后,1的琼脂 糖凝胶电泳观察结果. 1.4.2连接与转化将PCR产物纯化回收后连接 至pGEM,T—Easy载体,转化大肠杆菌DH5a.挑取 白色菌落,用质粒试剂盒提取质粒.经菌落PCR, B口H工与H,zd?酶切及电泳鉴定为阳性克隆,重 组质粒命名为pGEM—KZ/03VP1. 1.5重组表达质粒的构建分别用B口HI与 Hd?酶切pGEM—Kz/O3VP1及pET一28a载体, 酶切产物用1琼脂糖凝胶电泳,用胶回收试剂盒 对目的片段进行回收.将回收的目的片段和载体利 ? 64?生物技术中国畜牧兽医2009年第36卷第5期 用T4DNA连接酶连接,转入BL21感受态细胞,挑 斑,经菌落PCR,BnmHI与Hd?酶切及电泳鉴 定为阳性的克隆菌送上海生物工程公司测序,测序 分析后将重组质粒命名为pET28一KZ/O3VP1. 1.6不同浓度IPTG及诱导时间诱导表达重组质 粒参照分子克隆诱导表达蛋白的方法诱导表达蛋 白,预期表达蛋白分子质量为32ku. 1.6.1IPTG不同浓度诱导表达将阳性克隆菌 液与pET一28a空载体菌液分别按1:1()0接种于含 卡那霉素的LB培养液中,置振荡培养箱中经220 r/min,37?培养3h后,D.为O.5时分别加入 IPTG,使其终浓度为1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0, 4.5,5.Ommol/L,继续诱导4h,取样品进行处理与 SDS_PAGE电泳. 1.6.2IPTG不同时间诱导表达将阳性克隆菌 液与pET一28a空载体菌液分别按1:1O0接种于含 卡那霉素的LB培养液中,置振荡培养箱中经220 r/min,37?培养3h后,分别测D..为0.6与0.7 时菌体处于的对数生长期.加入终浓度为3mmol/ L的IPTG继续诱导,分别在2,3,4,5,6,7,8,9h 时取样品进行处理与SDS—PAGE电泳. 1.7样品处理与SDS—PAGE电泳分别取不同浓 度IPTG和不同诱导时间诱导的样品及空载体1 mL,12o0Or/min离心,弃上清,重悬沉淀,加2× SDSLoadingBuffer混匀后,煮沸5min.在5的 浓缩胶和12分离胶中进行SDS—PAGE电泳,经 l4OV,4Omin后,用考马斯亮兰R25O染色观察 结果. 1.8Western_blot分析将表达的蛋白质进行 SDs_PAGE电泳后,转移到硝酸纤维素膜,用含5 脱脂奶粉的PBST在4?条件下封闭过夜.洗涤 后,1:50稀释牛抗FMDVAsiaI型血清为一抗, 37?作用1h,洗涤5次后,加入1:5OO稀释辣根 过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG,继续作用1 h,洗涤后,用4一氯一1一萘酚显色. 2结果与分析 2.11基因克隆经1的琼脂糖凝胶电泳检 测PCR扩增产物,得到预期的VP1片段(图1),将 回收的VP1片段连人pGEM—T_Easy载体中,经 BnHI和Hd?酶切鉴定,证明VP1片段已连 人pGEM—T—Easy载体(图2). 2.2重组质粒扩增及序列分析经PCR和酶切鉴 定,并测序分析,证明VP1基因已连入表达载体 pET一28a中(图3,4). 图1VP1基因的PCR扩增 注:1.DL2()()OMarker;2,6,VP1基因PCR扩增产物. 图2pGEM-VPl酶切鉴定 注:1,DNAMarker(5OO,l5O0O);2,3,pGEMT—VP1(B口mH I+Hd?). 图3重组载体pET28-Kz/03VPl的PcR鉴定 注:1,DL2ooOMarker;2,6,重组载体pET28一Kz/O3VP1的 PCR扩增产物. 2.3表达产物的SDS_PAGE电泳取诱导后不同 样品进行SDS—PAGE,考马斯亮兰R250染色.结 果表明,在32ku处有一条特异的蛋白条带,与预期 大小一致,而未诱导的菌样未出现表达条带.发现 当IPTG浓度为3mmol/L,诱导9h时,蛋白表达 量最高(图5,6). 2.4western_hlot分析Western_blot结果发现, 表达的VP1蛋白能与牛抗口蹄疫阳性血清发生反 应,具有良好的免疫原性(图7). 一 宝曷 中国畜牧兽医2O.9年第36卷第5期生物技术?65? 图4重组载体pET28-KZ/O3VPl的酶切鉴定 注:1,DNAMarker(5OO,150OO);2,3,pET28一KZ/O3VP1 (Bn研H工+Hd?);4,pET28一KZ/O3VP1. 123456789l0 图5不同浓度IP】诱导表达VPl蛋白的sDPAGE电泳结果 注:1,蛋白质分子量(低);2,9,浓度分别为1.5,2.O,2.5, 3.O,3.5,4.O,4.5,5.Ommol/LIPTG诱导表达的VP1蛋 白;1O,pET一28a空载体表达蛋白. 12345678910 图6不同诱导时间诱导表达VP1蛋白的SDs_PA(电泳结果 注:l,蛋白质分子量标准(低);2,9,诱导时间分别为2,3,4,5, 6,7,8,9h时表达的VP1蛋白;1O,pErr_28a空载体表达蛋白. 3讨论 异丙基硫代p—D一半乳糖苷(IPTG),为一半乳糖 苷酶底物的类似物,是一种十分有效的乳糖操纵子 的诱导剂.在有IPTG诱导物存在的条件下,诱导 物可与阻遏蛋白结合成复合物,而使阻遏蛋白构象 发生改变,阻遏蛋白就不能结合到大肠杆菌中的 Lac启动子上,从而使乳糖操纵子能够被转录,诱导 蛋白的表达.IPTG的价格比较昂贵,尤其是在进 行大量诱导时,IPTG的应用会使成本增加(卢军 等,1997).探索IPTG最适诱导浓度成为节省成本 的途径之一. 46—— 31—— 24—— 19—— 图7VPl蛋自WesterI卜blot分析 注:1,蛋白质分子量标准;2,VPl蛋白. VP1蛋白是FMDV的主要结构蛋白,具有刺 激T,B淋巴细胞反应的多个抗原位点,能诱导淋巴 细胞产生保护性的中和抗体,是研究基因工程疫苗 的基础(马静云等,20O4).因此,VP1蛋白被广泛 应用于FMDV基因重组疫苗试验中,其表达量对 疫苗生产效率具有一定影响. 笔者参照分子克隆和VP1蛋白表达相关文章, 将IPTG浓度分别设为1.5,2.O,2.5,3.0,3.5, 4.0,4.5,5.0mmol/L,诱导相同时间,得知随IPTG 浓度增加蛋白的表达量并不会随之增大,确定 IPTG浓度为3mmol/L时,可以表达大量的VP1 蛋白.当IPTG浓度为3mmol/L时,分别诱导2, 3,4,5,6,7,8,9h,得知在菌体对数生长期内,随诱 导时间的延长,表达量会随之增大.最后确定当 IPTG浓度为3mmol/L,诱导表达9h时,VP1蛋 白表达量最大.本试验结果可为以后用重组蛋白生 产诊断或疫苗产品提供试验依据,节省IPTG的使 用量,降低生产成本,同时为生产效率的提高提供参 考依据. 参考文献 1马静云,陈峰,等.口蹄疫,,P1基因表达及免疫抗体检测[J].中 国兽医科技,2OO4,34(3):17,2O. 2卢军,刘春字,刘晓青,等.大肠杆菌生产重组人bFGF的发酵条 件[J].暨南大学(自然科学版),1997,18(3):95,99. 3杨素,吴小伦,花群义,等.口蹄疫病毒群特异性荧光PcR检测方 法研究[J].中国畜牧兽医,2004,31(11):44,46. 4BeardCW,MasonPW.Geneticdeterminants0fa1teredviru— lenceofTaiwanesefoot—and—mouthdiseasevirus[J].Virol, 2OOO,74:987,991. 5GurumurthyCB,SanyalA,Venkatar8mananR,eta1.Genetic diversity.intheVP1geneoffo0t—and—m0uthdiseaseVirussero— typeAsiaI[J].ArchVir0l,2oO2,147:85,1O2. kg;{gM ?66?生物技术中国畜牧兽医2009年第36卷第5期 弓形虫病分子诊断技术研究进展 任庆娥,周春香,菅复春,冯超,张龙现 (河南农业大学牧医工程学院,郑州45O0O2) 摘要:弓形虫病是一种呈世界性分布的人兽共患寄生虫病,严重危害人类健康并给世界各国的畜牧业造成巨大的经济损 失,但弓形虫病缺乏特异性临床症状,给该病的诊断带来很大困难.分子诊断技术的迅速发展为弓形虫病的诊断提供了快 速,灵敏,特异及稳定的检测方法.笔者从核酸分子杂交技术,聚合酶链反应(PcR),单克隆抗体(McAb)技术及生物芯片技 术几个方面介绍了用于诊断弓形虫病的分子诊断技术的研究进展. 关键词:弓形虫;核酸分子杂交技术;PCR;McAb技术;基因芯片 中图分类号:S852.7文献标识码:A文章编号:167卜7236(2OO9)05—0O66一O6 弓形虫病又称弓形体病,是由刚地弓形虫 (T00ngon)引起的一种呈世界性分布且 严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病.弓形虫是 一 种专性细胞内寄生原虫,免疫功能正常的人群感 染后多呈无症状带虫状态,但是在免疫功能受损的 收稿日期:2O08—1O一1O 作者简介:任庆娥(1981一),女,河南人,硕士生,主要从事人畜 共患原虫分子流行病学研究. 通信作者:张龙现(1965一),男,河南人,博导,教授,从事人畜共 患原虫生物学研究.E—mai1:zhanglx8999@yahoo. Com.Cn 基金项目:河南省高校创新人才培养工程项目(豫教高[2OO4] 294)资助. 6MateuMG.Ant|b0dyrec0gnition0fpic0mavirusesandescape fromneutralizationstructura1view[J].VirusRes,1995,38: 1224. 患者,免疫缺陷者及先天感染者常导致严重的后果; 孕妇感染可引起早产,流产甚至死胎;对于艾滋病患 者,弓形虫是最常见的机会性感染原虫之一,常可导 致严重的并发症甚至死亡.猪弓形虫病曾在中国养 猪场中大规模暴发流行(李祥瑞,2O04),死亡率可高 达60,给养猪生产造成巨大的经济损失.传统的 弓形虫病是以直接镜检,滋养体分离,卵囊分离和包 囊分离等病原学检查方法为主,此体系在过去近一 个世纪弓形虫病诊断和预防中曾起着重要的作用. 但传统的病原学检查方法费时,费力,亦由于其特异 性和敏感性差的原因,常常导致误诊,已越来越不能 适应当前弓形虫病诊断及防治的需要.随着分子诊 断技术的不断发展,国内外学者应用分子诊断技术 7W订dTF,BurroughsJN,BrownF.Surfacestructureoffoot— and—mouthdieasevirus口].JGenVir0l,1969,4(3):313,32O. Effect0fInducedC0ncentrati0nandTime0fIPTG0ntheExpressi0n 0fVP1Pr0tein0fFMDVTypeAsiaI WEIJie,,YIZhong.,WEIYu—rong,WANGHai—feng,,HUERMAXI,FUZi— hua.,RANDuo—liang (1.AnimalMedicalCo1legeofXinjiangAgricultureUniversity,Urumqi83OO52,China; 2.ResearchInstituteofVeterinaryScience0fXinjiangAcademyofAnimalSciences,Urumq i8300OO,China) Abstract:TheVP1geneofFMDVtypeAsia1wasinsertedintotheprokaryoticexpressionvec t0rpET一28a,andthen transformedintoBL21cel1s.Therecombinantp1asimdwasinducedwithdifferentconcentr ationandtime0fIPTGtoexpress theVP1protein.Thebetterexpressionconditionwasconfirmedbyanalyzingtheeffectofdifferentconcentrationandtimeof 1PTGontheexpressionproduct.Theexperimentalresultindicatedthattheexpressionproducthadnotbeenincreasedwith addingoftheconcentrati0n0fIPTGindefinitescope,buttheexpressionoutputhadbeenincreasedwiththeextension0ftime duringtheperiodoflogarithmicgrowthofbacteria.Themaxima1quantityofexpressi0nofVP1proteinwasc0nfirmedwhen theconcentrationofIPTGwas3mmo1/Landtheinducedtimewas9hours. Keywords:FMDV;AsiaI;VP1protein;expression;IPTG;concentrationinducement;inducementtime