肾康注射液与苯那普利对肾小球系膜基质作用的对比研究

肾康注射液与苯那普利对肾小球系膜基质作用的对比研究 肾康注射液与苯那普利对肾小球系膜基质作用的对比研究 内容提要 目的: 探讨肾康注射液与苯那普利对人肾小球系膜细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用强度。方法: 采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术，观察具有降逆泄浊、益气活血功效的中药肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。结果: 肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和?型胶原(Col ?)的作用，该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、Col ?也有一定的抑制作用，但不及肾康注射液作用明显。结论: 肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。 Contrast Study on Effect of Shenkang Injection and Benazepril on Human Glomerular Mesangial Extracellular Matrix Objective: To explore the intensity of inhibition of Shenkang Injection (SKI) and Benazepril on various ingredients of human glomerular mesangial extracellular matrix (ECM).Methods: Effect of SKI, a herbal preparation for lowering adverse Qi, despelling turbidness, supplementing Qi and activating circulation, and Benazepril were observed by cultured glomerular mesangial cell technique in vitro.Results: SKI could inhibit the fibronetin, laminin, and type ? collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit the fibronetin and type ? collagen of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of SKI was superior to Benazepril in inhibiting ECM. ? collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit nb sp;the fibronetin and type ? collagen of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of SKI was superior to Benazepril in inhibiting ECM. Key words Shenkang Injection, Benazepril, cell, extracellular matrix 肾小球疾病具有进行性加重的特征，而且各种类mesangial 型的肾小球疾病发展的最终结果都表现为肾小球硬化的形成。肾小球硬化是多种原因引起肾小球损伤后出现的共同转归，是慢性肾功能衰竭(CRF)的主要病理基础。近年来，随着对肾小球硬化机制认识的不断深入，肾小球系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖，减少ECM的堆积，拮抗细胞因子的不良作用，已成为防治肾小球硬 化，延缓CRF病情进展的重要环节。本研究采用人肾小球MC体外培养技术，观察了具有降逆泄浊、益气活血功效的肾康注射液对ECM中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)及?型胶原(Col ?)含量的影响，并以苯那普利作为阳性对照，冀从细胞水平探讨其延缓肾小球硬化的作用强度及作用机制。 材料与方法 1 材料 1.1 肾组织来源 系我校附属医院妇产科孕5月引产胎肾。 1.2 药物与试剂 肾康注射液(SKI)由大黄、丹参、红花等组成，成都中医药大学附属医院提供，每毫升含原生药0.3g;苯那普利(Benayzepril)由瑞士诺华制药有限公司生产，批号: 012200;V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品;RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品;小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均购于北京中山生物技术有限公司;LN、Col ?放射免疫分析试剂盒，均购于上海海研医学生物技术中心。 1.3 主要仪器 CO2孵箱(TYPE4型)德国HERAEUS公司生产;倒置显微镜(TOKYO)日本OLYMPUS公司生产;洁净工作台(月坛牌)北京半导体设备一厂生产;酶标分析仪(MODEL2550)美国BTO-RAD公司生产;FT-613自动计数125 I放免测量仪，北京核仪器厂生产。 2 MC培养与鉴定 无菌取胎肾，分离提取肾皮质小球组织，按照于力方等方法 (1)取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养，实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC，无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。 3 分组及MC上清的收集 吸取培养的第5代MC培养瓶中液体，加胰酶1ml，置孵箱(5% CO 2、37?)中消化3min，加10% FCS 1640终止液2ml，抽吸于离心管中，800rpm，离心3min，弃上清，加15% FCS 1640培养液于离心管中，吹打，混匀。用计数板计数后，倾入加样槽中，用8导加样枪，按每孔200μl，密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组(简称组?)、苯那普利组(简称组?)、肾康注射液高浓度组 1、2(简称组?、组?)、肾康注射液中浓度组 1、2(简称组?、组?)、肾康注射液低浓度组 1、2(简称组?、组?)，共8组(列)，每列6孔，待细胞贴壁24h后，每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外，其余各组分别依次加入苯那普利10,3mmol/L及肾康注射液100、50、2 5、12. 5、6.2 5、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待测。 4 测定ECM中FN的含量 用双抗体夹心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板，50μl/孔铺板，4?过夜，甩去。用PBS,吐温20洗涤液洗板3次，每次3min，间隔2min，控干。每孔加1%BSA封闭液100μl，37?，1h后甩去，控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl，37?，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA?PBS1?1000稀释)50μl/孔，室温放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA?PBS 1?1000稀释)50μl/孔，室温放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD显色液50μl，预热酶标仪，用2M H2SO4终止液50μl/孔终止，立即在492nm波长读数，并记录OD值。 5 ECM中LN、Col ?含量的放射免疫法(RIA)测定 采用竞争法，将缓冲液稀释10倍，分别将125 I,LN、抗LN血清、125 I,Col?、抗Col?血清及二抗用缓冲液稀释，将待测上清分别与125 I,LN、125 I,Col?及相应的抗血清混匀，4?过夜反应，加二抗4?反应60min，离心3500r/min 10min弃上清，125 I放射免疫测量仪计数。 6 统计学处理 数据均采用SDAS软件进行统计处理，结果用(?s)表示。 结 果 肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响见表1。表1所示，在对ECM中FN含量影响方面，肾康注射液组(?,?组)与空白对照组(?组)相比，均 有显着性差异(P,0.05,0.01);说明肾康注射液除低浓度组2(?组)外，其余各组对FN均有明显的抑制作用，而且随着浓度的递增此作用更加明显，并表现出一定的量效关系。实验还发现肾康注射液即使在极小浓度时对ECM中LN及Col ?的含量也有明显的抑制作用，该抑制作用也呈现出一定的量效关系。从表1还可看出，苯那普利组(?组)在对FN、Col ?含量影响方面，与空白对照组相比也有显着性差异(P,0.01,0.05);但对LN影响方面，两者比较无显着性差异(P,0.05);说明苯那普利对ECM中FN、Col ?也有一定的抑制作用，但对LN其抑制作用不明显。另外，从表中还可看出，肾康注射液各浓度组(?,?组)与苯那普利组相比，在抑制LN方面也均有极显着性差异(P,0.01);除肾康注射液低浓度组2(?组)外，其余各组与苯那普利组相比，在抑制Col ?方面也有显着性差异(P,0.01,0.05);肾康注射液高浓度组(?组)与苯那普利组相比，在抑制FN方面也有显着性差异(P,0.05);说明肾康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col ?含量方面优于苯那普利。 表1 肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响 (?s) 组别 n 药物 FN(OD值) LN(ng/ml) Col ?(μg/ml) ? 6 — 0.337?0.025 88.500?2.739 29.667?7.174 ? 6 Benazepril 10,3mol/L 0.295?0.055* 83.667?6。