肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增检测方法的建立和应用

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增检测的建立和应用 肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增 检测方法的建立和应用 位 大 容 报 研究生论文独创性声明 师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中 容之外,文中不包括其他人已经发表或撰写的研究成 进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 去闭平 日 弓 翩麓热日 年月中文摘 英文摘 研究论 引 第一部 丹 材 结 附 附 讨 小 参 第二部 刚 材 结 附 附表讨论参考文献 结论 综述 肠道病毒型和柯萨奇病毒组型检测方法研究进展? 致谢 个人简历??中文摘要 肠道病毒型和柯萨奇病毒组型环介导等温扩增 检测方法的建立和应用 摘 要 手足口病是儿童中常见的肠道病毒感染性疾病,肠道病毒型 和柯萨奇病毒组型是其主要病原。手足口病的 传染主要通过粪.口和口.口途径,其中接触感染者粪便污染的水、食物及 土壤可以导致粪一口传播。水是生命之源,由于干净安全饮用水的缺乏, 世界上每年都有大量人群发生疾病和死亡。近年来,的流行在亚太 地区呈上升趋势,甚至引起严重中枢感染或死亡,引起人们的密切关注。 传统的检测手足口病病原的方法通常需要?才能完成,而且操作繁琐、 灵敏度较低,不能满足临床上快速、灵敏的检测需要。因此,建立粪便及 饮用水源水中手足口病病原快速、灵敏的检验方法,对疾病的预防和辅助 检测、评估水源卫生质量和环境卫生状况具有重要的实用价值和现实意 ‘ 一一 . 义。 一 目的: 建立并优化和的舢汩检测体系,应用于手足口病的 病原检测。建立和的实时.?山癣检测方法并定量检测 天津市饮用水源水样品。 方法: 本研究基于和病毒基因组区利用软件出黼 反应的外引物和内引物。并对反应温度、镁离子浓度、甜菜碱浓度、 浓度等扩增条件进行优化。脚反应的总反应体系为皿,和 反应混合物分别在?和?孵育,然后在?加热 终止反应。舢心反应结束后通过以下几种方法判断扩增是否发生:一是 肉眼观察反应管的混浊度或向反应管中加入研 型染料后观察 反应管颜色的变化,二是通过琼脂糖凝胶电泳检测,此外也可通过酶切鉴 定?山口扩增产物。对株肠道病毒分别进行了砧唧反应来验证引物 的特异性,构建 和标准质粒模板,梯度稀释后验证砧唧 反应的灵敏性。中文摘要 采集例天津地区手足口病流行期间手足口病患儿的粪便标本,分别 用和的特异性引物对分离到的病毒进行及 检测。 本研究于年月至 年月,采集 个天津市饮用水源水样 品。用超滤离心管浓缩 正水样,提取总矾。实时剐旧分别 检测饮用水源水中的和。 结果: 该方法对和的检测有高度的特异性,与甲型肝炎病毒、 脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、柯萨奇、埃可及柯萨奇/肠道病 毒型等病毒均无交叉反应。触衄检测的灵敏性比传统的 检测方法高倍,检测的灵敏性比传统的检测方法高倍。 脚检测的检出率/.%高于/%, 脚检测的检出率与相当/%。说明这次手足 口病流行的主要病原是,同时存在的散发。通过两种方法 的比较,可知?山口比更快速、灵敏,有着更为广泛的发展前景。 超滤离心管浓缩病毒的回收率为.%。浊度仪实时触岬结果显 示,天津市饮用水源水中的/病毒浓度大约分别为至 .× ‘’和至.× ?一。 结论: 本研究建立的』山口检测/的方法具有特异性好、敏感 性高、节省时间的特点,并成功地应用于粪便及饮用水源水中 /的检测。 关键词:肠道病毒型;柯萨奇病毒组型;舢仰;手足口病; 粪便;饮用水源水英文摘要 ?心 萄 . ,盯一 ? . , . . 玛 够 . 妙 ,.?~ ?. ,. 印 时. 胁趾姗. 拶够 : ? ,印 ? 叩. ? 锄??田 锄 砌. : , 胁., .,形 .叼 英文摘要 ? “.? ? ? 加 . , , . 【 . 口?呼 锄弛,曲 .行 ,. 时 .删 行 口. , 锄丘’ 叫缸 【 锄 . 行 一 . 如 : 曲 .? ,, 姑 , , . 舢 / 趾?. “ 啪. / .% /%, / .%.巧 吐印, .铆 时 删 渤 仰 ?印 心?. 一 允】 巧 英文摘要.%. 矗.× /.× ? 矗 / ,玛. :,曲, 锄 锄 如. : ;伽;蛐;; ;研究论文 肠道病毒型和柯萨奇病毒组 型环介导等温扩增 检测方法的建立和应用 手足口病是儿童中常见的肠道病毒感染性疾病,肠道病毒型 和柯萨奇病毒组型是其主要病原。手足口病的 传染主要通过粪.口和口.口途径,其中接触感染者粪便污染的水、食物及 土壤可以导致粪.口传播。水是生命之源,由于干净安全饮用水的缺乏, 世界上每年都有大量人群发生疾病和死亡。近年来,的流行在亚太 地区呈上升趋势,甚至引起严重中枢感染或死亡,引起人们的密切关注。 传统的检测手足口病病原的方法通常需要.才能完成,而且操作繁琐、? 灵敏度较低,不能满足临床上快速、灵敏的检测需要。目前肠道病毒感染 常用的检测方法是反转录聚合酶链式反应;,采用多重实时荧光法可同时检 测 和,但是多重荧光法需要专门的实时荧光定量仪,, 而且荧光试剂和耗材的造价均较高,多数实验室不具备开展条件,也大大 提高了临床开展早期诊断的成本。 随着分子生物学技术的发展,核酸技术也在不断进步和完善。 等于年发明了一种体外恒温核酸扩增方法,即环介导的恒温扩增 叩. 彻锄,舢?。砧诳’法因其高效灵敏, 价格低廉,操作简单,不需要特殊仪器等优点,已成功应用于细菌、病毒、 寄生虫等多种病原微生物的快速检测。 因此,建立粪便及水源水中手足口病病原快速、灵敏的检验方法,对 预防疾病、评估水源卫生质量和环境卫生状况具有重要的实用价值和现实 立、、, 思义。研究论文 第一部分 /病毒检测方法的建立 及粪便样品检测 ??‘‘ 刖 吾 肠道病毒型 ,和柯萨奇病毒 , 组型,是引起手足口病.. ??的主要病原。 在临床上,和所致手足口病临床难以区别,而且在手足 口病流行期间和可共同存在,感染可引起严重中枢神 经系统疾病【,,】,如无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等神 经系统相关并发症发生,感染容易引发心肌炎、心包炎等并发症 【,,,,。因此,快速、简便、特异、高灵敏度地确定病原体对手足口病的 防控有重要意义。. 目前,’技术已成为快速诊断肠道病毒的重要手段。 检测肠道病毒【,,】的特点为检测快速、敏感性强、扩增产物可直 接定量、密闭系统防止交叉污染等,取得了良好的检测效果。但是. 法需要专门的实时荧光定量仪,而且荧光试剂和耗材的造价 均较高,多数实验室不具备开展条件,也大大提高了临床开展早期诊断的 成本。 等于年发明了一种体外恒温核酸扩增方法,即环介导的 法 恒温扩增. ,剐诳。 因其高效灵敏、价格低廉、操作简单、不需要特殊仪器等优点,特别适用 于各种核酸的检测,因而得到迅速推广。 本研究第一部分建立了肠道病毒及的砧汀检测方法, 并用于手足口病临床样品的实际检测,例粪便样品采集自 年月. 月间天津市儿童医院手足口病门诊初诊手足口病患儿。研究论文 材料与方法 材料 .酶和试剂盒 限制性内切酶觑酶、?肠酶、,;甜菜碱,;.克隆试剂盒、、姗、 珧、高纯度质粒小提试剂盒北京天根生化科技有限公司; 、 汀? 聚合酶、 克隆试剂盒北京全式金生物技术有限公司;。、、 片段快速纯化/回收试剂盒北京鼎国生物技术有限责任公司; ,。链霉素、氨苄青霉素华北制药股份有限公 司;病毒提取试剂盒,,限制性内切酶&做, ;无水乙醇天津市光复科技发展有限公司。 .培养基 液体培养基?。:胰蛋白胨,,酵母粉 ,, 天津市光复科技发展有限公司,., 。 ?高压灭菌 固体培养基:在液体培养基中加入.%/琼脂粉北 。 京索莱宝科技有限公司,.,?高压灭菌 .溶液 . . 儿, ×缓冲液:瞄 , ,冰醋酸. 。 蒸馏水溶解,补蒸馏水至 二甲基甲酰胺溶液中,一? .贮存液:将 ?溶于 储存备用。 ,蒸馏水定容至 配成 溶液: 蒸馏水溶解 %/的溶液,.岬滤膜过滤除菌,.?储存备用。 ,加入 灭菌双蒸水中,磁力搅 溴化乙锭溶液: 拌数小时以确保其完全溶解,然后转入棕色瓶中,?保存。 .仪器 砒 生物安全柜、? 高速冷冻离心机 涡旋振荡器 衄,、. ,,研究论文 电泳仪、聊 蛋白核酸测 /凝胶成像仪.己,, 定仪、 型仪』郇 ,,梅特勒.托利多天平 甜.,,一高压灭菌器?后, ,.暗箱式紫外透射仪北京鼎国生物技术有限责任公司, ...台式低温离心机上海安亭科学仪器厂,.台式恒温 振荡器、?峒.电热恒温水浴锅天津欧诺仪器仪表有限公司。 .研究对象 例手足口病患儿均为天津市儿童医院手足口病门诊年?月 间的门诊初诊病人。手足口病的诊断标准:口腔粘膜出现溃疡性疱疹包 括烦粘膜、舌、唇、牙龈、咽部粘膜,伴或不伴有低热,患儿的手心、 手背、足心、足趾侧面相继出现水疱样皮疹【。 方法 .标准克隆载体的构建 .. 扩增引物及扩增条件 的引物及扩增条件 引物、结合于病毒基因组中的区域,目的片段长 度为 ,引物序列如下: :’.’.’ :’..’ ,? ,? 扩增条件:? ,个循环,最后?延 。 伸 短片段引物及扩增条件 引物、结合于病毒基因组的区域,目的片段 长度为,引物序列如下: :’. .’ :’.门.’ ,? ,? 扩增条件:? ,个循环,最后?延 。 伸 长片段引物及扩增条件 引物、结合于病毒基因组的区域【】,目的片段文 长度为,引物序列如下: :’.,不.’ :’.’ ,? 扩增条件:? ,? ,个循环,最后?延 。 伸 . 每次扩增均设阳性对照或和阴性对照灭菌蒸馏 水。扩增结束后,取此产物在.%琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像 系统中观察结果并照相。 .. 体系 反应为此体系: 体系成分 加入量/止 上游引物州 下游引物州 . ×缓冲液含 .一。 . :..’ 酶一 模板 。 补足到 无菌去离子水 .. 产物的纯化快速纯化/回收试剂盒 采用北京鼎国生物技术有限责任公司的快速纯化/回收试剂盒 完成产物的纯化。操作步骤:?切取含片段的琼脂糖 .,用吸头捣碎按重量比:切取重量:溶液的体积比 加入溶液。??水浴,胶完全溶化即可,其间振荡助溶.次, 待溶化后置室温加入止溶液,充分混匀。如果体积大于止,可 适当增加溶胶时间。?将溶液置于离心柱中,静置,?/离 心.。若一次加不完可分两次离心。?倒掉液体,加入此溶液 于离心柱中,/离心.,弃液体。?重复上述步骤。? /离心,甩干剩余液体以除去残余酒精。?将离心柱置于新 的离心管中,室温开盖放置.,使乙醇挥发尽。?加入.此溶 /离心,管底溶液即为 液?水浴,静置。? 所需。将储存于.?可长期保存。研究论文 .. 产物与载体的连接 的产物与载体的连接采用天根生化科技北京有 限公司的试剂盒,连接体系如下。 连接体系中的成分 加入量/此 目的片段水 ?载体约‖止 虢 × /此 无菌去离子水 补足到 木载体与片段的摩尔比控制在:.: 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。将混合反应液置于?过 夜反应。反应结束后将离心管置于冰上。 的产物的连接采用北京全式金生物技术有限公司 的试剂盒,连接体系如下: 连接体系中的成分 加入量/此 .. 产物木 无菌去离子水 补足到 水根据产物量可适当增减,最多不超过止,最佳插入片段 量载体与片段摩尔比: 轻轻混合,?仪控温反应。反应结束后,将离心管 置于冰上。 ..重组质粒的转化 转化实验前需制备好筛选重组质粒所需平板。制备方法:向铺好的 /的固体琼脂平板表面加入皿的%和止的. ‖,使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于.?放 置.,使溶解.的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。 重组质粒的转化采用天根生化科技北京有限公司的试 剂盒。具体转化步骤:?加连接产物于.皿感受态细胞中在 感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物,轻弹混匀,冰浴。?将离 心管置于?水浴,取出管后立即置于冰上.,其间不要摇动离研究论文 心管。?加止?预热的,/,?孵育。?将离心 管中的菌液混匀,吸取止菌液铺板,待平板表面干燥后,倒置平板, ?过夜培养。?将平板在?放置,使蓝色充分显现,挑出白色菌 落做进一步分析。 重组质粒的转化采用北京全式金生物技术有限公司的 试剂盒。具体转化步骤:?加连接产物于衄.感受态细胞中在 感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物,轻弹混匀,冰浴.。?? 热激,立即置于冰上。?加此平衡至室温的,/, ?孵育。?取止菌液铺板,培养过夜为得到较多克隆,/ 离心, 弃掉部分上清,保留.止,轻弹悬浮菌体,取全部菌 液涂板,培养过夜。?将平板在?放置,使蓝色充分显现,挑出白 色菌落做进一步分析。 ..重组质粒的提取 质粒提取采用天根生化科技北京有限公司的试剂盒,具体步骤: ?柱平衡步骤:向吸附柱中吸附柱放入收集管中加入止的 平衡液 /离心,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新 放回收集管中。使用当天处理过的柱子。?取.过夜培养的细菌 培养液于.离心管中,/离心。尽量吸除上清。?向 留有菌体沉淀的离心管中加入止溶液,涡旋器彻底悬浮细菌细胞 沉淀。?向离心管中加入止溶液,温和的上下翻转.次使菌体 充分裂解。所用时间不应超过。?向离心管中加入止溶液, 立即温和的上下翻转.次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。 /离心,用移液器小心的将上清转移到过滤柱过滤 柱放入收集管中,尽量不要吸出沉淀。?/离心,小心的 将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱中吸附柱放入收集管 中,/离心.,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入 收集管中。?向吸附柱中加入止的去蛋白液,/离 心.,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。?向吸 附柱中加入止的漂洗液,室温静置.,印离心 .,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。重复一次。 ?将吸附柱放入收集管中,/离心,将吸附柱开研究论文 盖,置于室温放置数分钟,目的是将吸附柱中残留的漂洗液去除。?将吸 附柱置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加 . 皿洗脱缓冲液,室温放置,/离心,将质 粒溶液收集到离心管中。也可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,重复 步骤?,得到的产物保存在.?。 ..重组质粒的酶切鉴定 参考.载体图谱,利用&酶酶切重组质粒。 酶切体系如下: 酶切体系中的成分 加入量/止 × . ‘ 髓?酶 . 提取的重组质粒 约 .反应条件:?温浴过夜。 载体图谱,利用觑知?酶酶切重组质 参考 粒, 酶切体系如下: 酶切体系中的成分 加入量/皿 × . . 肺咒酶 提取的重组质粒 约 .反应条件:?温浴过夜。用琼脂糖凝胶电泳判定结果。 . 舢唧检测体系的建立与优化: ..引物设计 对中的和基因组的己知序列进行同源性分 析,选取肠道病毒基因组中保守的区段作为目标序列。根据 和姒的区核酸序列,利用在线软件 /.设计』山伊扩增引物, //.//厂一?二 、 设计的和目的片段长度分别是和,见 。针对目的片段的六个特异区域分别设计四条引物,包括两条内引物 、和两条外引物、。由的一个互补序列和正向 序列构成;由的一个互补序列和正向序列构成。矩形框内 序列分别是姚和&?酶切位点。 引物的处理:将合成回来的引物稀释成岬/、和 岬/、浓度的贮存液,放入.?冰箱保存备用。 ..操作程序 反应体系首先至于?或?水浴锅中反应 ,然后转入?水浴锅中终止反应。 ’ ..扩增条件的优化 ... 扩增条件的优化 浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,的浓度依次设为.、 .、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果,选择最 优矿浓度?’. 浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,的浓度依次设为 .、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果,选择最 优啪浓度。 甜菜碱浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,甜菜碱的浓度依次设为 .、.、.、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果, 选择最优甜菜碱浓度。 反应温度的优化 为了验证温度对舢汩试验的影响,反应体系中成分维持不变,设 计梯度温度依次为.、.、.、.、.、.、.?,琼脂糖 凝胶电泳检测反应结果,选择最优温度。 ... 扩增条件的优化 矿浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,的浓度依次设为.、研究论文 .、.、.、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果, 选择最优浓度。 浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,的浓度依次设为 .、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果,选择最 优,浓度。 甜菜碱浓度的优化 反应条件和反应体系中其他成分维持不变,甜菜碱的浓度依次设为 .、.、.、.、.、./,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果,选择 最优甜菜碱浓度。 反应温度的优化 为了验证温度对触旧试验的影响,反应体系中成分维持不变,设 计梯度温度依次为.、.、.、.、.、.、.?,琼脂糖 凝胶电泳检测反应结果,选择最优温度。 ..优化得到的和病毒?山口最佳反应体系 “ 一 ?反应体系:~,? ?体系成分 加入量/皿 内弓物和 ?夕、弓物和 . ×缓冲液 . 甜菜碱聚合酶 模板 无菌去离子水 补足到 混匀后加入山矿物油。 ?山口反应体系: ?山伊体系成分 加入量/此 ?内弓物矛口 “夕’弓物和研究论文 . ×缓冲液. 甜菜碱 町 聚合酶 模板?姑 无菌去离子水 补足到 混匀后加入“矿物油。 .. 触旧反应的特异性 以常见的肠道病毒,如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、 柯萨奇、埃可及柯萨奇/肠道病毒型分别作为验证和 病毒?山口扩增体系特异性的对照。提取上述病毒基因组 作为?山口反应的模板,按照最优体系进行舢心反应,琼脂糖凝胶电 泳判定结果。 .. 舢旧/反应灵敏性 一一 蛋白核酸测定仪测定和病毒刽汩检测标准克隆质粒 模版的浓度,在. /的区间内进行倍梯度稀释。按照上述 ’ 优化后触旧体系进行检测,体系中模版加入量为肛。同时,为了 评价本研究建立的和病毒伽反应体系的灵敏度,对比 进行了反应,反应条件见..。和病毒反 应采用的引物是相对应的?引物组中的两条外引物和见表 和表。 .. 脚产物分析 触汩产物的可视结果分析 ?山口反应终止后,即可通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀判断检 ×,阳性扩增为绿色, 测结果。也可在产物中加入止研 阴性结果为橙红色。 』山田产物的凝胶成像分析 夕山口反应结束后,取扩增产物用%琼脂糖凝胶电泳判定结果。 砧洄产物酶切结果的分析 为了确认扩增产物结构, 脚扩增产物被?口限制性内切酶消化: 一.酶切反应条件是反应体系在?恒温过夜酶切反应。取酶切产物 位混合均匀,用.%琼脂糖凝胶进行电泳判 止,与此的 定结果。 .临床样品的采集与制备 ..粪便样品的采集 采集患儿就诊当天粪便置于灭菌采便管内,外表贴上与患者信息 相对应的标签,?冷藏小时内运送至天津市职业与环境危害生物标志 物重点实验室,保存样品于.?冰箱。 ..粪便标本的处理液: 完全液中加入青霉素、链霉素,并且青霉素终浓度为单位 触,链霉素为嵋/。 完全液的配制:取以下份液和份液加到份液中 即为完全工作液。 液: 试剂品名 加入量/ . 研究论文 . . 唧无水 . 用.蒸馏水溶解以上盐类,加蒸馏水补至, 印分钟高压灭菌,即为不完全工作液不含钙、镁离子。 液: 试剂品名 加入量/ . ’ 溶解于蒸馏水中,分钟高压灭菌。 液: 试剂品名 加入量儋 . 分钟高压灭菌。 溶解于正蒸馏水中, ..粪便标本的处理 操作步骤:?在离心管上标记标本号;?空管中加入和 氯仿;?在生物安全柜中取大约粪便标本加入标记好的离心管中确 保离心管上的标号与原始标本的标号一致;?剩余的原始标本留在原容 器中,仍冻存于.?;?确保拧紧离心管管盖,用涡旋器剧烈震荡; ?在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下,用冷冻离心机在 条件下离心;?在生物安全柜中将每份标本的上清液分别 吸入个有外螺旋盖的冻存管中如果上清液不清澈,应再用氯仿处理 次;?管粪便悬液冻存于一?作为备份,另管存于?.?以提取 病毒黜蛆。 ..病毒砌妊提取 使用公司的病毒提取试剂盒提取病毒,具体操作 步骤如下:?取此忆髓含枷砌蛆于.儿离心管中, 加入止粪便悬液,涡旋震荡;?室温.?放置后, 短暂离心使液体都离心到离心管底部;?加入止乙醇%.%, 涡旋震荡 ,短暂离心。如样品体积大,按照比例加乙醇,如样品体积 为止时,加入此乙醇%.%;?小心的将皿上述溶 液加入柱中,/离心。将柱子取出置于新的离心管研究论文 中。如仍有残留液体,使用更大转速离心,至液体全部离心下来;?重复 步骤?;?加入止,/离心。将柱子取出置于新离 心管中;?加入止,/离心;?将柱子置于新的 离心管中,高速离心,去除残留;?将柱子置于新的离心管中, 加入×止,室温放置,/离心。: .硎 斟必须新鲜配置,.?可保存,如产生沉淀,使用前 于?加热溶解,加热次数不能超过次,每次加热时间不能超过。 ..反转录体系 反转录反应为止体系: 反转录体系成分 加入量/此 ×.‖ /? 一嵋.疔 :一轻轻混匀,于?孵育,?孵育,最后?加热 。整个反转录过程置于仪完成。 失活 ..粪便样品舢洄/检测 将所提取的粪便样品作为模板,经过反转录后,加入相应的 舢旧/体系检测样品,触旧检测方法见.,结果判定方法详见., 检测方法见..,琼脂糖凝胶电泳检测反应结果。 ..生物安全 根据年月日卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》, 柯萨奇病毒、埃可病毒、型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于 危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下,对临床和现场 的未知样品检测操作可在生物安全级或以上防护级别的实验室进行, 涉及病毒分离培养的操作,应加强个体防护和环境保护。 操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全,要在 级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定,无脊灰疫苗免疫史 的人员要进行脊灰疫苗免疫。研究论文 结 果 脚反应条件的优化 . 舢反应条件的优化 矛浓度的优化 本试验对浓度进行了优化,结果如图所示。当反应体系中 浓度在./../范围内梯形条带逐渐变亮后又逐渐变暗;当 反应体系中浓度达到./时,梯形条带最亮。确定反应体系 中适宜的浓度为./。 浓度的优化 伽反应最大的特点是合成大量核酸的同时,生成副产物焦磷酸镁 白色沉淀。因此,对体系中的,进行了优化,如图所示。 浓度在.几../时均出现梯形条带,当./时条带最 亮,确定最适浓度为./。 甜菜碱对舢唧反应的影响 由图可知,当反应体系中甜菜碱浓度在.尼’./时梯形 条带逐渐变亮后又逐渐变暗;当反应体系中甜菜碱浓度达到./时, 梯形条带最亮。确定反应体系中适宜的甜菜碱浓度为./。 反应温度的优化 设计温度梯度为.?、.?、.?、.?、.?、.?、 .?,从图中可以看出,.泳道都产生了梯形条带,说明.?..? 温度下都能进行反应,当.?条带最亮,因此选择作为最适温度。 . 扩增条件的优化 浓度的优化 本试验对浓度进行了优化,结果如图所示。当反应体系中 浓度在./../时梯形条带逐渐变亮后又逐渐变暗;当反应 体系中分浓度达到.咖/时,梯形条带最亮。确定反应体系中适 宜的矿浓度为./。 浓度的优化 舳反应最大的特点是合成大量核酸的同时,生成副产物焦磷酸镁 白色沉淀。因此对体系中的进行了优化,如图所示。浓研究论文 度在./../时均出现特异性梯形条带,当./时条 带最亮,确定最适浓度为./。 甜菜碱对脚反应的影响 由图可知,当反应体系中甜菜碱浓度在./../时梯形 条带逐渐变亮后又逐渐变暗;当反应体系中甜菜碱浓度达到./时, 梯形条带最亮。确定反应体系中适宜的甜菜碱浓度为./。 反应温度的优化 设计温度梯度为.?、.?、.?、.?、.?、.?、’ .?,从图中可以看出,.泳道均产生了特异性梯形条带,当.? 条带最亮,因此选择作为最适温度。 ’ 脚反应的特异性 从图和图可知,对于本研究建立的和病毒』山田 检测体系,分别以甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、柯萨奇 、埃可及柯萨奇/肠道病毒型病毒为模版扩增,均未 产生特异扩增的梯形条带。因此本研究建立的和病毒 一 邶检测体系特异性强。 脚反应的灵敏度 如图所示,病毒舢唧体系在标准质粒模版稀释到 /此时电泳出现梯形条带。而稀释到/止时未出现梯形 条带,即检测的灵敏度达到/止。病毒检测体 系在标准质粒模板稀释到 /止时电泳出现目的条带。而稀释到 /止时未出现目的条带。即检测的灵敏度达到 后,阳性扩增 /此。病毒舢田产物中加入 为绿色,空白对照为橙红色见图。 如图所示,病毒』山口检测体系在标准质粒模版稀释到/此时电泳出现梯形条 带。而稀释到 /止时未出现梯形 条带。即病毒砧旧检测体系的灵敏度达到/皿。 病毒检测体系在标准质粒模板稀释到/此时电泳出现目的 条带。而稀释到 /此时未出现目的条带。即检测蛆的灵敏 后, 度达到/此。病毒』山口产物中加入?? 阳性扩增为绿色,空白对照为橙红色见图。研究论文 从实验数据比较剐旧和常规的灵敏度可知,本研究建立的 触洄检测方法更加灵敏,其灵敏度是的.倍。 扩增产物的酶切鉴定分析 为评价产物特异性,用特异的限制性内切酶消化舢汩扩增产物, .%琼脂糖凝胶进行电泳判定结果。根据表和表可知,病毒 扩增产物被限制性内切酶?口消化后应产生和的片 断;病毒舢旧扩增产物被限制性内切酶&?消化后应产生 和的片断。实际酶切结果如图所示,与理论上的预期值 相符。 粪便样品检测结果 为评估本研究建立的和检测方法的效果,掌握天津市 年间手足口病病原情况,我们采集了年月至月间天津地区 流行的手足口病患儿的粪便样品例,将本研究建立的和 病毒山口检测方法应用到实际样品的检测中并与传统的检测方法 做平行比较。在例检测样品中,触唧检测得到阳性例, 阳性例;检测得到阳性数例,阳性数 例,而且?检测的阳性样品与的检测阳性样品完全符合。上述 结果说明本研究建立的和病毒舢检测方法在实际样品 的检测中可靠性高,而且较传统的方法灵敏性更高见表。结合 脚扩增的特点分析,舢方法在临床样品的检测中比方法具 有更高检出率的原因首先是脚方法自身扩增的效率比方法高, 其次剐汩方法较少受到实际样品中抑制剂的影响。研究论文 附 图 口 ? 口 加 嘶 ‰ 一. ./; 培 肌 ?. . .. /; /; /; ../;.. /;量 口 口 口 抽 ? 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