鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的达及其重组马立克氏病毒的构建 扬州大学 博士学位论文鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达及其重 构建 姓名:刘红梅 申请学位级别:博士 专业:预防兽医学 指导教师:秦爱建 20050501 刘红梅:鸡传染性法氏囊瘸病毒,,,基斟的表达及,,,;重组马正克氏病毒的构建 ～ 鸡传染性法氏囊病病毒,,,基因的表达及其 重组马立克氏病毒的构建 博士研究生 刘红梅 导 师 秦爱建教授 摘要 鸡传染性法氏囊病(,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,，，,,)是由传染性法氏囊病病毒 (，,,,)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病。该病主要侵害,,,,周龄的雏鸡与青年鸡，破坏法氏囊中的,淋巴细胞，导致不同程度的免疫抑制，从而使病鸡增加对并发和继发性病毒和细菌感染的易感性。近年来，由于，,,,超强毒株和变异株的流行，导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变，使得传统的疫苗已不能控制其流行，因此，发展更为有效、安全的新型疫苗已成为迫切需要。以,,,疫苗作载体构建活病毒载体疫苗是近年来禽病毒基因工程研究中比较活跃的领域。多年的生产实践证实了,,, ,,,,,,疫苗的安全性、有效性。因此，本研究选用,,,,,,疫苗作载体，插入，,,, ,,,保护性抗原基因，筛选重组病毒，并对其免疫特性进行了研究。, ，,,, ,,株,,,基因真核表达载体的构建及其免疫特性 应用,,,,,,从，,,, ,,株中扩增出,,,基因，并克隆入,,,,(, ,,,,载体。序列测定分析结果表明，，,,, ,,株的,,,基因与国际标准强毒株编码的氨基酸序列具有极高的同源性(,,(,—,,(,,)。系统进化树分析表明，,,株和香港,,,,、日本,,,,、英国,,,,,等毒株的关系最近。随后将,,,基因克隆入真核表达载体,;,,,,(,,,,,(，)，构建成功真核表达质粒,;,,,,，,,,,,，用,;,,,,(,(,,,体外转染,,,(,细胞，结果证明,,,基因能在,,,一,细胞中表达。利用,;,,,,(,(,,,质粒进行基因免疫，结果发现雏鸡二免后,,天可在体内检测到特异性抗,,,抗体，对,,,,,,,的，,,, ,,超强毒攻击的保护率为,,,，这一结果提示,,,基因具有良好的免疫原性，可以作为研制，,,,基因工程疫苗的目的基因。, ,,, ,,， ,,,转移载体的构建 根据，型,,,强毒,,株基因序列，三对引物，用,,,方法扩增出,,,,,,,,,,,,,,株的,,区、,,,,区及其侧翼序列，分别克隆入,,,,(, ,,,,载体中，测序表明所克隆的基因片段与，型,,,强毒,,株基因序列完全一致。然 二,,五年扬州人学博士学位论文后将,,，,,,,及其侧翼序列分别插入,,,,,载体中，构建成功,,,,,,,,，,和,,,,,,,,,,质粒。在此基础上将含,,,启动子的,,,,基因表达盒分别插入上述两种质粒，构建成功含,,,,基因的转移载体质粒,,,,,(,,】,,,,,,和,,,,,,,,(,,,,。分别用两种质粒与活病毒同源重组，成功地在,,, ,,,,区筛选出表达,,,,的重组病毒(,,,,,,,一,,,,,,,,,)。经多次传代证明,,,,,,,(,,,,(,,,,在感染的鸡胚成纤维细胞(,,,)中能稳定表达,,,,，且其形态和生长特性与亲本毒株一致。实验结果表明本研究构建的,,,,,(,,,,,,,,,转移载体质粒正确，,,,,是,,,复制非必需片段，为构建重组，,,,基因工程疫苗奠定了基础。,表达，,,, ,,,融合蛋白的重组,，),的构建及其免疫特性 将,,,,报告基园与，,,, ,,,基因融合，插入,,,,, ,,,,,质粒中，通过酶切鉴定证明构建表达,,,融合基因的,,, ,,,,,,转移载体,,; , ,,,,,,,,,,,(,,,质粒正确。将转移载体质粒与,,,,,,,,,,,,,,疫苗毒共转染,,,，筛选得到表达,,,,—,,,融合基因的重组,,,(疋,,,,,(,,,,,,,,)。经,,,和，,,证实，疋,,,,,一,,,,(,,,病毒传至第,,代仍能稳定表达,,,,(,,,融合蛋白。用此重组病毒免疫,,,鸡，进行攻毒保护实验，结果表明当以,,,,,,,、,,,,,,,、,,,,,,,的,,,,,,,(,,,,(,,,分别对,日龄,,,鸡进行免疫，在,,日龄用,,,,,,,的，,,, ,,超强毒攻毒，鸡的免疫保护率分别为,,,、,,,、,,,。值得注意的是，当以,,,,,,,一次免疫, ,,龄,,,鸡，其保护效果与常规中等毒力活疫苗,次免疫的效果无显著性差异(,,,，,,)，与生理盐水对照组的差异极显著,口,,(,,)，这充分显示出,,,,,,作为载体研制，,,,基因工程疫苗的广阔应用前景。,表达，,,,—,,,基因的重组,,,的构建 以真核表达载体,;,,,,(,一,,,质粒,,,为模板扩增包含,,,启动子和,,,,,的,,,基因表达盒，插入,,, ,,,,,,,,,,,,,,,的非必需区,,,,片段中 (,,;,,,,,,,)，通过酶切鉴定证明所构建的表达,,,基因的,,, ,,,,,,转移载体,,,,,一,,,,,,,,『,确，将转移载体质粒与,,,,,,,,,,,,,,疫苗毒共转染,,,，筛选到了表达,,,基因的重组,,,(,,,,,,,,,,,)。经,,,，和,,,,证实，,,,,,,,(,,,传至第,代仍能稳定表达,,,蛋白，有关,,,,,,,,,,,其他免疫学特性正在进行中。关键词;重组马立克氏病毒;传染性法氏囊病毒;,,,,,,,,,,,,,,;,,,蛋白:转移载体:免疫特性 刘红酶:玛传染件法氏囊。„一帽毒,,,世洲的表逃及心薯匀【马，,克氏,由毒盼构建 ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,, ，,,,;,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,, ,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,?, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,(, ,,,,,,,,,:,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,:,,,,(,,,,,, ,,, ,,,,,,;, ，,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,(，,,),, ,,, ,;,,,(,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,;,,,, ,, ;,,;,,,, ,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,, ,, ,,,,,;,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,,, , ,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,【，,,,)(,—,,,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ，,,, ,,,,;,,,,，,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,;, ,,;,,,,,, ,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,;,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,(,,;,,,,,(,,, ,,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,; 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,,,, ,,,,,,,,(,,,;, ,,,,;,,,, ,, ,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,, ,,,, ,, ，,,, ,,, ;,,,,, ,,,, ,;,,,,(,,,,,(，),,;,,, ,, ,,,,,, ,,,,;,,,,(,一,,,(,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ;,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,;,, ,,,;,,,; ,, ，,,, ,, ,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,( ,,,;,,,, ,,;;,,,,,, ,,,, ,;,,,,(,一,,, ,,,, ;,,,,,,,,, ,,,, ，,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,, ,,,;,,,; ,,,,—，,,, ,,,,,,,, ;,,,, ,, ,,,,;,,, ,, , , ,,,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,, ;,,;,,,, ,,, ,,,,,;,,, ,,,, ;,,,,,,,, ,,,, , ,,,,,,，,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,:,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,; ;,,,,,,, ,,,,,,, ，,,, ,,,,;,,,,(, ,,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,, ,,, ,, ,,, ,,【, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,,,,, ,,？,,,;, ,, ,,,“,,,,,,,,„„,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ， ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,(,,,, ,,,,, ,,,, ;,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,, ,,;,,, ,,,,,一,,,, ,,, ,,,—,,(,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,, ,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,, ,,, ;,,,,, ,,,,,,,, ,,,,?, ,,, ,,,, ,一,, ,,;,,, ,, ,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,一,,,, ,,,, ,,„,,,, ,,, ,,, , ,一,,—,,,,(, ,,;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,一,,,,一,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,(,,, ,,,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,似,;,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,一,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,;,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ,, , ,, ,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,，,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,;,,), ,,, ，,,,,,,,,,;,, ,,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,,,, ,,、，,,;;,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ，,,,,,,, , ,,;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,(,,,,),,,,, ,, ,,, ,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ，,,, ,, ,,,,,,”。,,,;,,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,,(,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,一,,,,—,,,)(,,,, ,,, ,,,,,, ,, , , ,,,,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,, ,,,，,, ,,,,,,,,(,,,;,,,, ,,;;,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,一,,,,—,,, ,,,,, ,, ,,,,,;,,, ,,,,;,,,,,,,, ,,,, , ,,,,,, ,, ，,,, ,,(,,, ,,,,,;,,,, ,,,,, ,, ,,, ;,,;,,,, ,,;;,,,,,, 刘红梅:鸡传染性法氏囊,芮病毒, ,,基因的表达及其重组马奇,克氏炳毒的构建 ,,,出,,, , ,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,，,,,，,,, ,,,，,,,,,;,,,,,,，;,,,,,,, ,,,, , ,,,,, ;,,;,,,, ,,;;,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,, ，,,,,,;;,,, ,,, ,,,;, ,,,,,,,,,,,,,(,,, ;,,;,,,, ,,;;,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,一,,,,—,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,, ,,,, ，,,, ,, ,,,,,, ;,,,,,,,,(;,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,, ,,,,,(,,,(, ,)(,,,,,,,，,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,,;,,;,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,—,,, ,,, ,,,,, ,,;;,,,,,,，,,, ,,,, ,,;;,,, ,,, ,, ,,,,(,,)(,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,;,,,,,,;,,,,,,,, ,,,,,,,,, ，,,, ,,;;,,, ;,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,】, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(, ,,,,, ,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,, ,, ,,, ,,, ,, ，,,, ,, ,,;,,,,,,,,,,, ,,;;,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,, ,,,, ,,,, , ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,, , ,一,, , ,,;,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,，,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,, ,,, ;,,,,, ,,,, ,,, , ,?,, ,, ,,;,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,,，,—,,,(, ,,;,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,(,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,凫;,,, ,,,,,,,,,,,,一,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,;,, ;,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,一,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,,,:,,;,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,，,～,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,加岱，,,,,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,;,,,,,,,, ,,;,,; ，,,,,,,,,,;,, ,,,,,;,,,,,,,,,, , ,,五年扬州，,人学博,:学位论文 符号说明 符号 外文全称或说明 中文说明 ,,, ,,,,;,,,,, 氨苄青霉素 ,, ,,,,, ,, ,,,,,;,,, 法氏囊,,, ;,,;,,, ,,, ,)?, ,,,,,,,,,, 鸡胚成纤维细胞,,, ;,,,,,,,,,,,,,, 巨细胞病毒,,, ;,,,,,,,,,,,,; ,,,,;,, (致)细胞病变效应,,, ;,,,,,,,; , ,,,,,,;,,, 细胞毒性,淋巴细胞,,,, ,,,,,;,„, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, 基础培养基,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, 增强型绿色荧光蛋白,，,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,;,,,,,, 异硫氰酸荧光素,,, ,,,, ,,,,,,,, 鸡痘病毒,, ,,,;,,,,,,,, , 糖蛋白,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 辣根过氧化物酶,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, 火鸡疱疹病毒，,, ，,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, 传染性法氏囊病，,,, ，,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, 传染性法氏囊病毒,,, ,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,,;,,;, ,,,,, 间接免疫荧光试验，,,, ,—,—,,,,,,,,,,,,,,, 异丙基硫代一,,,,,,,,,— 口一,一半乳糖苷,,;, ,,,,—,,,,;,,,,,,,, ,,,,,半乳糖苷酶,,,, ,,,,,,,,, ,,,, 半数致死量,, ,,,,,„, ,,,,,,, 马立克氏病,,, ,,,,,„, ,,,,,,, ,,,,, 马立克氏病病毒,,, ,,,,,,,,,,,,,,,?,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, 开放阅读框,,【， ,,邻苯二胺,,, ,,,, ,？,, ,,,,,,, ,,,, 蚀斑形成单位,,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,?, ,,,,,,, ,,,,, 重组马立克氏病毒,,, ,,,;,,,; ,,,,,,,, ,,,, 无特定病原,, ,,,,,,,,, ,,,,,, 胸苷激酶,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, 末端重复序列,, ,,,, ,,,？,, ,,,,,, 长独特区,, ,,,,, ,,,？,, ,,,,,, 短独特区,』,,, ,,,,, ,,,？,, ,,,,,, 短独特区,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,?, ,,,,,,, ,,,,, 马立克氏病病毒强毒株,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,„, ,,,,,,, ,,,,, 马立克氏病病毒超强毒株,,，,,, ,,,,,,,, ,,,,,„, ,,,,,,, ,,,,, ,,,, 马立克氐病病毒特超强毒株,(,,， ,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,—,?,,,,;,,,,, ,,溴,,,氯一,,吲哚,,一,,半乳糖苷 , 刘红梅:鸡传染性法氏囊病病毒,,,基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建 ，文献综述一 马立克氏病毒表达载体的芯拷 ?近年来，病毒分子生物学的发展，为构建重组病毒建立了丰富的理论基础和可靠的实验材料。随着对,,,的基因结构与功能方面的深入研究，特别是对,,,基因组的测序成功，促进了,,基因工程疫苗的研制和开发。通过基因工程手段将烈性传染病和难于培养的病原保护性抗原插入,,,活病毒载体进行表达，进而筛选,,,的重组病毒以预防禽类多种传染病，达到一针防多病的目的，正成为国内外实验室和疫苗公司研究的热点。,马立克氏病毒的分子生韧学特性 ,,,是一种细胞结合性疱疹病毒，其嗜淋巴细胞的特性与,(疱疹病毒相似，而其分子结构和基因组成与,疱疹病毒相似…。,,,为较大的有囊膜的双链,,,病毒，基因组约为,,,一, ,,,,。,,,在胞核中复制，并利用细胞的酶系统。基因组约有,,,的非必需区(,,,)，可插入约,,,,的外源片段。这些部位的缺失，不会影晌病毒的感染性,,】。 根据血清型反应不同，,,,分三个血清型:，型包括致瘤的,,,及其传代后失去致病性的弱毒株，如,,，,、,,,和,,株;，，型为非致瘤性自然弱毒株，如,,—,、,,、,,,,,，;，，，型为无致病性可用作疫苗的火鸡疱疹病毒(,,,)，代表株,,一,,,。毒力或致瘤性仅与，型,,,有关，，，型,,，，，，型没有发现能作为禽类宿主的致病原。 所有三个血清型的基因组都含有一独特长区(,,)和一独特短区(,,)，每一区域都与反向重复序列(氓)相连，其模式为:,,,(独特长区末端重复序列),,,—，,,(独特长区反向重复序列)(，,,(独特短区反向重复序列)(,,(,,,(独特短区末端重复序列)(图,)。现已建立了马立克氏病病毒血清,、,、,型的限制性内切酶片段的物理图谱口,。 二,,五年扬州大学博士学位论文 目前已测定出,,,血清，型,,株、,,,株:血清，，型,,,,,,株和血清三型,,, ,,(,,,株的全基因组序歹,,,,?,】。,,,的,,区有,,个开放阅读框架(,,,)，,,有,,个,,,，其中,个与,,,,,的功能区同源，即,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,,等，还包括,个,,,独有的,,,,,—,,,,,，对于,疱疹病毒来说，,,是病毒复制主要,,,,,〕。 熙啊霸盯,两附,丽矿,赫网珊,卜卜攫 啦,, 耗 啦啦 ; ,,,,?筝墨磐鬯咎警些磐塌酷髻墼名墼举 ,? ? 轴 ? ,，, 刚鞋 柚 ? , 琏 , ? 鼬 ,,,, 图, ,,,基因组结构模式图 注:,,,,独特长区末端重复序列;,,,,独特短区末端重复序列;，,,一独特长区反向重复序列 ,,(独特短区;,,(独特长区;，,,?独特短区反向重复序列,马立克氏病毒表达载体的优越性 ,,,是能诱导自然宿主产生肿瘤的一种细胞结合性病毒，也是能用实验方法证明具有致瘤性的第一个病毒，,,用非致病性的,,,或致弱的,,,株作为疫苗，可以成功地预防本病的发生，使之成为世界上第一个用疫苗预防肿瘤的成功例子。 在养禽业，用,,,血清,、,、,型疫苗控制,,的发生已有,,多年，多年的生产实践证实了,,,疫苗作为活病毒载体的安全性、有效性。以,,,作为禽病毒活载体的研究始于,,年代，随后构建了,,,血清,型,,,,,,,株，,,,血清,型,,,,,,,,,,,,,,株病毒载体，然后插入其他病毒宿主保护性抗原，均获得了不同程度的免疫保护,“剐。 ,,,作为重组疫苗载体，与其他病毒载体比较，有一些潜在的优势: ,),,,在鸡,日龄时进行免疫，免疫出现早，免疫,次即可在体内维持数 刘红梅:鸡传染性法氏囊病病毒,,,基因的表达及其重组马立克氏病毒的构建周的病毒血症，免疫持续时间长; ,),,,属细胞结合毒，通过细胞接触传播，受母源抗体干扰相对较少; ,),,,的自然宿主仅限于禽类，对家畜和人类是安全的; ,),,,基因组较大，确定了多处病毒非必需区，病毒血清代表株基因组序列测序完毕，且构建重组病毒的技术已很成熟。,重组马立克氏病毒构建的一般方法 重组,,,的构建方法主要有两种:同源重组法和细菌人工染色体(,,,)法。,,,法是最近几年发展起来的一种,,,载体系统，它具有容量大(至少,,,,,)，遗传稳定，操作简单等优点。该方法首先要构建,,,全基因组序列的人工染色体，其次通过常规的同源重组法将含有目的基因的,,,,,质粒与含有,,,全基因组 序列的人工染色体在细菌水平重组，用获得的重组,,,的,,,转染细胞以获取具有感染性的克隆。,,,技术在分析严格细胞结合性,,,的基因及其产物上，应用前景非常广阔。在这里主要介绍前,种同源重组法。,(,构建原理 原理是将外源目的基因插入载体病毒基因组的某些部位，使之高效表达但不影响该疫苗株的生存与繁殖。接种这种重组病毒疫苗后，它可在体内繁殖并表达插入的外源基因产物，从而刺激相应疾病的免疫保护力。 具体来说，第一步构建重组质粒，又叫转移载体，此质粒应含有启动子，下游接待表达的外源基因，有时为方便筛选，还要插入有启动子的标记基因如,,;,、,,,等，它们的两侧为,,,特异的,,,序列，第二步是将重组质粒导入,,,感染的细胞中，,,, ,,,与转移质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组，从而将外源基因组装到,,,基因组的特定部位，构建出重组病毒(如图,)。 在构建重组质粒时，外源基因两侧的同源序列应大于,,,,,，同源序列越长越有利于重组。但总的来说，这种方法一般重组概率较低(,,,,,,,(,,,,)，原因是野生型病毒自身增殖而产生高背景，这使重组病毒的筛选十分困难，尤其是在外源基因不是标记基因的时候【,】。,(,马立克氏病毒复制非必需区的确定 根据上述同源重组的原理，外源基因要导入,,,的基因组中(必须首先插入: 三竺旦至兰堑型查兰堡兰兰竺堡(兰到基因组复制非必需区，然后依靠外源基因两侧的非必需区重组臂来与,,,基因组相对应区段进行同源交换，从而将外源基因带到基因组中。因此，病毒基因组复制非必需区的 “,～,;??,勰卅““ ,克隆和筛选是活病毒载体构建的先决条件。 、、,，，, ,;, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,, , ,,,, ,啪鞠喇。棚，,?自, 宁圜 ,口?, ,,,,,,抽 ,,口口,峙, ,，啪 ,,,,,, 如,—,,,,,,,,喇妇,, ,,),,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, 悲愁‖鹅“帅哪 ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, , ,,,, ,,;,,,,,,, 如，,,(，),,，，, .