[应用]分子生物学课后答案

[应用]分子生物学课后答案 第一章 绪论 1.简述孟德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。 答:孟德尔的对分子生物学的发展的主要贡献在于他通过豌豆实验，发现了遗传规律、分离规律及自由组合规律;摩尔根的主要贡献在于发现染色体的遗传机制，创立染色体遗传理论，成为现代实验生物学奠基人;沃森和克里克在1953年提出DAN反向双平行双螺旋模型。 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答:脱氧核糖核酸(DNA, Deoxyribonucleic acid)， 核糖核酸(RNA, Ribonucleic acid) 3.试述“有其父必有其子”的生物学本质。 答:其生物学本质是基因遗传。子代的性质由遗传所得的基因决定，而基因由于遗传的作用，其基因的一半来自于父方，一般来自于母方。 4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质,写出这些实验的主要步骤。 答:一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡; 二，噬菌体侵染细菌的实验:1，噬菌体侵染细菌的实验过程:吸附?侵入?复制?组装?释放。 2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少;蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部;而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验:1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系(S株系和HR株系)的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 5.请定义DNA重组技术和基因工程技术。 答:DNA重组技术:目的是将不同的DNA片段(如某个基因或基因的一部分)按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。 基因工程技术:是除了包含DNA重组技术外还包括其他可能是生物细胞基因结构得到改造的体系，基因工程是指技术重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 6.写出分子生物学的主要研究内容。 答:1，DNA重组技术;2，基因表达调控研究;3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学;4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章 染色体与DNA 1.染色体具有哪些作为遗传物质的特征, ?分子结构相对稳定 ?能够自我复制，使亲子代之间保持连续性 ?能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程 ?能够产生可遗传的变异 2.什么是核小体,简述其形成过程。 由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。核小体是由H2A,H2B,H3,H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bp的DNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体外面。每个核小体只有一个H1。所以，核小体中组蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A,H2B,H3,H4各两个，H1一个。用核酸酶水解核小体后产生只含146bp核心颗粒，包括组蛋白八聚体及与其结合的146bpDNA，该序列绕在核心外面形成1.75圈，每圈约80bp。由许多核小体构成了连续的染色质DNA细丝。 核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一阶段。在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩至原尺寸的1/7。200bpDNA完全舒展时长约68nm,却被压缩在10nm的核小体中。核小体只是DNA压缩的第一步。 核小体长链200bp?核酸酶初步处理?核小体单体200bp?核酸酶继续处理?核心颗粒146bp 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体 ，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色质包装的三级结构。 4.这种超螺线管进一步螺旋折叠，形成长2-10μm的染色单体，即染色质包装的四级结构。 4. 简述DNA的一,二,三级结构的特征 DNA一级结构:4种核苷酸的的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学结构 DNA二级结构:指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构 DNA三级结构:指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构 5.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征, 1, 结构简练 原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质，只有非常小的一部分不转录，这与真核DNA的冗余现象不同。 2, 存在转录单元 原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单元或转录单元，它们可被一起转录为含多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA。 3, 有重叠基因 重叠基因，即同一段DNA能携带两种不同蛋白质信息。主要有以下几种情况? 一个基因完全在另一个基因里面 ? 部分重叠 ? 两个基因只有一个碱基对是重叠的 6.简述DNA双螺旋结构及其在现代分子生物学发展中的意义 DNA的双螺旋结构分为右手螺旋A-DNA、B-DNA和左手螺旋Z-DNA。 DNA的二级结构是指两条都核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 右手螺旋----是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定的 一条由5’到3’另一条由3’到5’。两链上的碱基以氢键相连，嘌呤和嘧啶碱基对层叠与双螺旋内侧，顺着螺旋轴心从上向下看，可见碱基平面与纵轴平面垂直且螺旋的轴心方向穿过氢键的中点。核苷酸的磷酸集团与脱氧核糖在外侧，通过磷酸二酯键相连接而构成DNA分子的骨架。DNA转录时其链板间与有它转录所得的RNA链间形成A-DNA这对基因表达有重要意义 左手螺旋----是右手螺旋的一个补充。Z-DNA调控基因转录模型中，在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被Z-DNA抑制，只有Z-DNA转变为B-DNA后，转录才得以活化，而在远距离调控系统中，Z-DNA可以通过改变负超螺旋水平，决定聚合酶能否与模板链相结合而调节转录起始活性。 7 .DNA复制通常采取哪些方式 1 线性DNA双链的复制 将线性复制子转变为环状或多聚分子 在DNA末端形成发夹式结构 使分子没有游离末端 在某种蛋白质的介入下，在真正的末端启动复制 2 环状DNA双链的复制 θ型 滚环型 D—环型 8.简述原核生物DNA的复制特点。 (1)复制的起始 1， DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，这是一个有多种蛋白质和酶参与的复杂过程。 (2) DNA复制的引发 RNA引物的合成 前导链:DNA双链解开为单链后，由引发酶(RNA聚合酶， Primase)在5’ ?3’DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA 聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。然后以此为起点，进入DNA复制的延伸。后随链:后随链的引发过程由引发体(Primosome)来完成。引发体由6种蛋白组成的引发前体(Preprimosome)和引发酶(Primase)组成。引发体催化生成滞后链的RNA引物短链， 再由DNA聚合酶III 作用合成后续DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列。 (3) 复制的延伸 冈崎片段与半不连续复制 在原核生物中，DNA 新生链的合成主要由DNA 聚合酶III所催化。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I 通过其5'?3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈 崎片段作为引物由5'?3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。 (4) 复制的终止 DNA复制的终止依赖与Tus蛋白(Terminus utilization substance，36kD)和DNA链上特殊的重复序列Ter(约22bp)。Tus-ter复合体将阻止DNA解链，等反方向的复制叉到达后停止复制，然后两条链解开。最后，释放子链DNA，依靠拓扑酶将超螺旋结构引入DNA分子。 9.真核生物DNA的复制在哪些水平上受到调控 1细胞生活周期水平调控(限制点调控)即决定细胞停留在G1期还是进入S期 2染色体水平调控即决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制 3复制子水平调控即决定复制的起始与否 10. 细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复 错配修复 切除修复 重组修复 DNA直接修复 SOS系统 11.什么是转座子,可分为哪些种类, DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子(transposon, Tn)是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。转座子分为两大类:插入序列(IS)和复合型转座子。 1. 插入序列 插入序列是最简单的转座子，它不含有任何宿主基因。它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个序列。转座子常常被定为到特定的基因中，造成该基因突变。 2. 复合型转座子 复合型转座子是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。大部分情况下，这些转座子的转座能力是由IS序列决定和调节的。 除了末端带有IS序列的复合转座子外，还存在一些没有IS序列的，体积庞大的转座子(5000bp以上)——TnA家族。 12请说说插入序列与复合型转座子之间异同 转座子是存在于染色体DNA上的可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而被称为插入序列(IS)，他们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。她常常被定位到特定的基团中，造成基因突变。、 复合式转座子是一类带有某些抗药性基因的转座子，其两翼是相同的或高度同源的IS序列，且IS序列是不能单独移动的只能作为复合体移动而且IS序列也决定和调节转座子的转座能力。也是有没有IS序列的转座子Tna家族，其两翼带有38bp的倒置重复序列 第三章 生物信息的传递,上,---从DNA到RNA 1,什么是编码链？什么是模版链？ 答:与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链(或有意义链);另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成DNA链称为模版链(或反义链)。 2,简述RNA转录的概念及其基本过程。 答:RNA转录:以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。基本过程:模版识别—转录开始—转录延伸—转录终止。 3.大肠杆菌的RNA聚合酶有哪些组成成分,各个亚基的作用如何, 答:大肠杆菌的RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成的核心酶，加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶。α亚基肯能与核心酶的组装及启动子的识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用; β亚基和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，β亚基能与模版DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。 4.什么是封闭复合物、开放复合物以及三元复合物, 答:模版的识别阶段，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭性复合物;封闭性复合物形成后，此时，DNA链仍然处于双链状态，伴随着DNA构象的重大变化，封闭性复合物转化为开放复合物;开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二脂键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物。 5.简述σ因子的作用。 答:1.σ因子的作用是负责模版链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模版上的启动子; 2.σ因子可以极大的提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力; 3.σ因子还能使RNA聚合酶与模版DNA上非特异性位点结合常数降低。 6.什么是Pribnow box？它的保守序列是什么？ 答:pribnow box是原核生物中中央大约位于转录起始位点上游10bp处的TATA区，所以又称作-10区。它的保守序列是TATAAT。 7.什么是上升突变？什么是下降突变？ 答:上升突变:细菌中常见的启动自突变之一，突变导致Pribnow区共同序列的同一性增加;下降突变:细菌中常见的启动子突变之一，突变导致结构基因的转录水平大大降低，如Pribnow区从TATAAT变成AATAAT。 8.简述原核生物和真核生物mRNA的区别。 答:1，原核生物mRNA常以多顺反子的形式存在。真核生物mRNA一般以单顺反子的形式存在;2，原核生物mRNA的转录与翻译一般是偶联的，真核生物转录的mRNA前体则需经转录后加工，加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作;3，原核生物mRNA半寿期很短，一般为几分钟 ，最长只有数小 时。真核生物mRNA的半寿期较长， 如胚胎中的mRNA可达数日;4，原核与真核生物mRNA的结构特点也不同，原核生物的mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly A结构。 9.大肠杆菌的终止子有哪两大类,请分别介绍一下它们的结构特点。 答:大肠杆菌的终止子可以分为不依赖于p因子和依赖于p因子两大类。 不依赖于p因子的终止子结构特点:1.位于位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。2.在终止位点前面有一端由4—8个A组成的序列，所以转录产物的3’端为寡聚U。 依赖于p因子的终止子的结构特点:1.ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。2. 终止过程需要消耗能量,ρ因子具有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。 10.真核生物的原始转录产物必须经过哪些加工才能成为成熟的mRNA,以用作蛋白质合成的模版。 答:1，装上5′端帽子;2，装上3′端多聚A尾巴;3，剪接:将mRNA前体上的居间顺序切除，再将被隔开的蛋白质编码区连接起来。剪接过程是由细胞核小分子RNA参与完成的，被切除的居间顺序形成套索形;4，修饰:mRNA分子内的某些部位常存在N6-甲基腺苷，它是由甲基化酶催化产生的，也是在转录后加工时修饰的。 11.简述?、?类内含子的剪接特点。 答:?类内含子的剪接主要是转酯反应，即剪接反应实际上是发生了两次磷酸二脂键的转移。在I类内含子的切除体系中，第一个转酯反应由一个游离的鸟苷或者鸟苷酸介导，鸟苷或鸟苷酸的3’—OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二脂键，从上游切开RNA链。在第二个转酯反应中，上游外显子的自由3’—OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二脂键，使内含子被完全切开，上下游两个外显子通过新的磷酸二脂键相连。 ?类内含子主要存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，在?类内含子切除体系中，转酯反应无需游离鸟苷或鸟苷酸，而是由内含子本身的靠近3’端的腺苷酸2’—OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二脂键，从上游切开RNA链后形成套索结构。再由上游外显子的自由3’—OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二脂键，使得内含子被完全切开，上下游两个内含子通过新的磷酸二脂键相连。 12.什么是RNA编辑？其生物学意义是什么？ 答:RNA 编辑是指某些RNA特别是mRNA前体经过插入、删除或取代一些核苷酸残疾等操作，导致DNA所编码的遗传信息的改变，使得经过RNA编辑的mRNA序列发生了不同于模版的DAN的变化。生物学意义:1，校正作用，有些基因在突变的途中丢失的遗传信息可能通过RNA的编辑得以恢复;2，调控翻译，通过编辑可以构建或去除其实密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种方式;3，扩充遗传信息，能使基因产物获得心得结构核功能，有利于生物的进化。 13.核酶具有哪些结构特点？其生物学意义是什么？ 答:核酶的结构特点:核酶的锤头结构特点是:三个茎区形成局部的双链结构;其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸; 生物学意义:1，核酶是继反转录现象之后对中心法则的有一个重要的修正，说明RNA既是遗传物质又是酶;2，核酶的发现为生命起源的研究提供了新思路—--也许曾经存在以RNA为基础的原始生命。 第四章 生物信息的传递,下,----从mRNA到蛋白质 1.遗传密码有哪些特征, 答:1，密码的连续性，密码之间无间断也没有重叠;2，密码的简并性，许多氨基酸都有多个密码子;3，密码的通用性和特殊性，遗传密码无论在体内还是在体外，无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的，但是也有少数例外;4，密码子和反密码子的相互作用。 2.有几种终止密码子,它们的序列和别名分别是什么, 答:3种，UAA、UAG和UGA，别名是无意义密码。 3.简述摆动学说。 答:1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动学说，解释了反密码子中某些稀有成分的配对。摆动学说认为，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。认为除A-U、G-C配对外，还有非标准配对，I-A、I-C、I-U，并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对，而第3个碱基可以非标准配对，具有一定程度的摆动灵活性。 4.tRNA在组成和结构上有哪些特点, 答:1.tRNA中含有稀有碱基,除ACGU 外还含有双氢尿嘧啶、假尿嘧啶等; 2.tRNA分子形成茎环节构; 3.tRNA分子末端有氨基酸接纳茎; 4.tRNA分子序列中很有反密码子。 5,比较原核与真核的核糖体组成。 答:1，真核细胞中的核糖体数量多余原核;2，真核细胞中核糖体RNA占细胞中总RNA的量少于原核;3，原核生物的核糖体通过与mRNA的相互作用，被固定在核基因组上，真核生物的核糖体则直接或间接的与细胞骨架有关联或者与内质网膜结构相连;4，原核生物核糖体由约RNA占2/3及1/3的蛋白组成，真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。 6,什么是SD序列？其功能是什么？ 答:SD序列是指信使核糖核酸(mRNA)翻译起点上游与原核16S 核糖体RNA或真核18S rRNA 3′端富含嘧啶的7核苷酸序列互补的富含嘌呤的3,7个核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖体小亚基与mRNA结合并形成正确的前起始复合体的一段序列。 功能:SD序列对mRNA的翻译起重要作用。 7.核糖体有哪些活性中心, 答:核糖体包括多个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位(A位点)，结合或接受肽酰-tRNA部位(P位点)，肽基转移部位及形成肽键的部位(E位点)，此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。 8,真核生物与原核生物在翻译起始过程中有哪些区别？ 答:原核生物的起始tRNA是fMet-tRNA，真核生物是Met-tRNAMet。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模版相结合，再与fMet-tRNA结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模版mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S.mRNA.Met-tRNAMet起始复合物。 9,链霉素为什么能够抑制蛋白质的合成？ 答:链霉素是是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，可以多种方式抑制原核生物核糖体，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。 10,什么是信号肽？它在序列组成上有什么特点？有什么功能？ 答:绝大部分被运入内质网腔的蛋白质都带有一个信号肽，该序列常常位于蛋白质的氨基端，长度一般都在13-16个残基，有如下三个特征:1，一般带有10-15个疏水残基;2，在靠近该序列N端常常带有一个或 ，在其C端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸。功能:完整的信者数个带正电荷的氨基酸;3 号肽是保证蛋白质转运的必要条件。 11，简述叶绿体蛋白质的跨膜运输机制。 答:1，活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内;2，叶绿体膜能够特异性的与叶绿体蛋白的前体结合;3，叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异; 12，蛋白质有哪些翻译后的加工修饰, 答:1、氨基端和羧基端的修饰;2.共价修饰:磷酸化、糖基化、羟基化、二硫键的形成;3.亚基的聚合;4.水解断链，切除新生肽中非功能片段。 13,什么是核定位序列？其主要功能是什么？ 答:核定位序列:蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。在绝大多数多细胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，核膜被破坏，等到细胞分类完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内，为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽----被称为核定位序列。 第五章 分子生物学研究法,上,------DNA、RNA及蛋白质操作技术 2. 如何理解PCR扩增的原理和过程。 答:PCR扩增的原理及过程 该技术模拟体内天然DNA的复制过程，其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环 30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ? 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93?左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备; ? 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55?左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ?引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2,4分钟，2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。 第七章 基因的表达与调控,上,------原核基因表达调控模式 1.简述代谢物对基因表达调控的两种方式。 答:? 转录水平上的调控(transcriptional regulation); ? 转录水平上的调控(post-transcriptional regulation) ，包括mRNA加工成熟水平上的调控(differen, tial processing of RNA transcript)和 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。 2.什么是操纵子学说 1961年，法国科学家莫诺(J?L?Monod，1910-1976)与雅可布(F?Jacob)发表“蛋白质合成中的遗 传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。 莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌的乳糖代谢。 乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶(叫做“半乳糖苷酶”)，能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖苷酶的基因(简称z)是一个结构基因(structural gene)。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻的结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这样，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。 上述内容表明，大肠杆菌的乳糖操纵子是一个十分巧妙的自动控制系统:当培养基中含有充分的乳糖，同时不含葡萄糖时，细菌便会自动产生半乳糖苷酶来分解乳糖，以资利用。当培养基中不含乳糖时，细菌便自动关闭乳糖操纵子，以免浪费物质和能量。 3.简述乳糖操纵子的调控模型。 答:A、乳糖操纵子的组成:大肠杆菌乳糖操纵子含 Z、Y、A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列 O，一个启动子 P 和一个调节基因I。 B、阻遏蛋白的负性调节:没有乳糖存在时，I 基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列 O 处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶;有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。 C、CAP 的正性调节:在启动子上游有 CAP 结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境 时，cAMP 浓度升高，与 CAP 结合，使 CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖操纵子启动序列附近的 CAP 结合位点，激活 RNA 聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。D、协调调节:乳糖操纵子中的 I 基因编码的阻遏蛋白的负调控与 CAP 的正调控两种机制，互相协调、互相制约。 4. 什么是葡萄糖效应? 又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内cAMP含量降低，启动子释放cAMP-CAP蛋白，RNA聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应 5.什么是弱化作用, Trp答:1.当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNA也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区(或停留在两个相邻的trp密码子处)，这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。 2.当培养基中色氨酸浓度较高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2-3区不能配对，3-4区自由配对形成基一环终止子结构，转录被终止，trp操纵子被关闭。 6.简述抗终止子的调控机制 在以mRNA为模板翻译多肽是，当核糖体遇到终止密码是如果没有其他的情况一般都会停止翻译，但当有其他因素存在例如，色氨酸操纵子的调控中的弱化作用，这些因素会使核糖体不能够在终止信号处终止肽链的延伸，叫做抗终止 7.简述反义RNA的调控机制 反义RNA，根据反义RNA的作用机制可将其分为3类 ?类:这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制(?A类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶?的敏感性增加，使其降解(?B类)。?类:这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。?类:这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。 8.简述原核基因转录后调控的不同方式 转录的起始由RNA聚合酶与DNA模板的启动子(promoter)结合。 经过对百种以上原核生物不同基因的启动子进行分析，发现启动子具有下列的共同点:在-10bp处有一段共有序列(consensus sequence)，富含AT，即 –TATAAT-，系Pribnow等首先发现，因而称为Pribnow盒(box)，再往上游-35bp的中心处又有一组保守的共有序列，即-TTGACT-。启动子邻近的结构示如图13-3。 结合过程可分为二个步骤，首先由σ因子辨认启动子的–35区，全酶与该区结合，形成疏松的复合物，此时DNA双链未解开，因而称为封闭型转录起始复合物，继而RNA聚合酶移向–10区及转录起始点，在–20区处DNA发生局部解链，形成12,17bp的单链区，RNA聚合酶与DNA结合更紧密，形成开放型转录起始复合物。以单链的模板链为模板，RNA聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的NTP占据，聚合酶的β亚基催化第一个磷酸二酯键的生成，σ亚基从全酶解离，形成DNA-RNA聚合酶(核心酶)结合在一起的起始延伸复合物。 第八章 基因的表达与调控,下,------真核基因表达调控一般规律 1.基因家族的分类及其主要表达调控模式。 答:(1)，简单多基因家族，真核生物首先是pre rRNA经过特异性甲基化，然后是经RNA酶的切割便可产生成熟rRNA分子。原核生物则还要经过核酸酶降解才能产生成熟rRNA分子。(2)，复杂多基因家族，一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位，可能存在具有不同专一性的组蛋白亚类和发育调控机制。(3)，发育调控的复杂多基因家族，每个基因家族中，基因排列的顺序就是他们在发育阶段的表达顺序。 2，何为外显子和内含子及其结构特点和可变调控, 答:大多数真核基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列组成的，编码序列称为外显子(exon)，非编码序列称为内含子(intron)。结构特点:一个结构基因中编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起，而是常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式。可变调控:不少真核基因的原始转录产物可通过不同剪接方式，产生不同的mRNA，并翻译成不同的蛋白质。另外，一些核基因由于转录是选择了不同的启动子或者在转录产物上选择了不同的PolyA位点而使转录产物产生不同的二级结构，因而影响剪接过程，最终产生不同的mRNA分子。 3，DNA甲基化对基因表达的调控机制。 答:大量研究表明，DNA甲基化能关闭某些基因达的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。三种调控机制:一是DNA甲基化导致了某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质和DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。二是促进阻遏蛋白的阻遏作用。三是DNA的甲基化还提高了该位点的突变频率。 4，真核生物转录元件组成及其分类。 答:启动子，转录模版，RAN聚合酶?基础转录所需的蛋白质因子(TF?)，RNA聚合酶?，增强子，反式作用因子 5，增强子的作用机制。 答:增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。可能有3中作用机制:(1)，影响模版附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子鱼启动子之间“成环”连接，活化基因转录。(2)，将模版固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶?在DNA链上的结合和滑动。(3)，增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶?进入染色质结构的“入口”。 6，反式作用因子的结构特点及其对基因表达的调控。 答:反式作用因子是能直接或间接的识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 结构特点:同一类序列特异性的反式作用因子由多基因家族所编码, 它们具有特定的蛋白质结构(如上述的锌指结构、碱性亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋基元等)和蛋白质结构上的同源性, 因而构成反式作用因子家 族, 如类固醇激素受体家族、AP1家族等。 主要包括: 1.DNA结合域: a.螺旋-转角-螺旋 b.锌指结构 c.亮氨酸拉链 d.螺旋-突环-螺旋 [1]2.转录激活域:与其他转录因子相互作用的结构成分。常见的转录激活结构域有富含谷氨酰胺结构域，富含脯氨酸结构域及酸性α螺旋结构域 随着表观遗传学的发展，研究发现除了蛋白，DNA、RNA也有调控功能，所以现在也称反式调控元件，主要有miRNA，转录因子等 7，举例说明蛋白质磷酸化如何影响基因表达。 答:蛋白质磷酸化主要影响细胞信号转导进而影响基因表达。举例:在糖原代谢过程中，激素与其受体在肌细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，后者再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解途径并提供ATP。(cAMP介导的蛋白质磷酸化过程) 8，组蛋白乙酰化和去乙酰化影响基因转录的机制。 答:组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶通过是组蛋白乙酰化和去乙酰化对基因表达产生影响。组蛋白N端尾部上赖氨酸残基的乙酰化中和了尾部的正电荷，降低了它与组蛋白的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质结合的变化，从而提高了基因转录的活性。核心组蛋白H2A,H2B,H3,H4通过组蛋白尾部选择性乙酰化影响核小体的浓缩水平和可接近性。由于乙酰化的组蛋白抑制了核小体的浓缩，使转录因子更容易与基因组的这一部分相接触，有利于提高基因的转录活性。 9，激素影响基因表达的基本模式。 答:许多类固醇激素(如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素)以及一些代谢性激素(如胰岛素)的调控作用都是通过起始基因转录而实现的。靶细胞具有专一的细胞质受体，可与激素形成复合物，导致三维结构甚至化学性质的变化。经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核与染色质的特定区域结合导致基因转录的起始或关闭。靶细胞内含有大量激素受体蛋白，而非靶细胞中没有或很少有这类受体，这是激素调节转录组织特异性的根本原因。 10，分子伴侣的分类及其影响基因表达的机制。 答:分子伴侣(molecular chaperone)是一类序列上没有相关性担忧共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能帮助其他多肽进行正确的折叠、组装、运转和降解。目前认为分子伴侣至少有两类:热休克蛋白家族和伴侣素。 把能与某个(类)专一蛋白因子结合，从而控制基因特意表达的DNA上游序列称为应答元件(response element)，如热休克应答元件，这些应答元件与细胞内转移的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。 第十一章 基因组与比较基因组学 1.简述人类基因组计划的科学意义(详细答案见教材P424) 人类是在“进化”历程上最高级的生物，对它的研究有助于认识自身、掌握生老病死规律、疾病的诊断和治疗、了解生命的起源。 测出人类基因组DNA的30亿个碱基对的序列，发现所有人类基因，找出它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。 在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究:大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。 HGP的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。 2.请分析人类基因组计划的发展趋势 人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能，每个基因与某种疾病的种种关系，真正对生命进行系统地科学解码，从此达到从根本上了解认识生命的起源、种间、个体间的差异的原因，疾病产生的得机制以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象目的。 3.试述大肠杆菌基因组和真核生物基因组的主要区别 (一).大肠杆菌基因组 1基因组很小，大多只有一条染色体 2结构简炼 3存在转录单元 4多顺反子 5有重叠基因 (二)真核生物基因组 1真核基因组结构庞大 2单顺反子 3基因不连续性 4非编码区较多 5含有大量重复序列 4.列出LINEs与SINEs的异同 LINES: 哺乳动物基因组中长散布序列，由RNA 聚合酶II转录本反转座产生 哺乳动物基因组含有很多相对短但彼此相关的序列，其重要部分包含转座子。大部分可归纳为两个家族，即长散布重复序列(LINES) 和短散布重复序列(SINES) 。这些成分当初曾被认为是一些分散重复序列:每个家族都包含许多成员分散在基因组中。LINES 和SINES 的一个更重要的区别是，LINES 是RNA 聚合酶?的转录物，而SINES 则是RNA 聚合酶?的转录物。 5.区分遗传图谱和物理图谱，试述这两项技术的优缺点 前者是描述的基因相对位置，后者是具体的碱基位置 遗传图谱是某一物种的染色体图谱(也就是我们所知的连锁图谱)，显示所知的基因和/或遗传标记的相对位置，而不是在每条染色体上特殊的物理位置。由遗传重组测验结果推算出来的、在一条染色体上可以发生的突变座位的直线排列(基因位点的排列)图。 物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离,碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb),的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。 6.什么是FISH技术,如何利用它来构建基因组的物理图谱, FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 7.鸟枪测序法的技术原理是什么, 一种分析大片段基因组DNA序列的策略。系将大片段DNA(如噬菌体文库中约40 kb长或细菌人工染色体所含350 kb长的DNA插入片段)随机切成许多1,1.5 kb的小片段，分别对其测序，然后借助序列重叠区域拼接成全段序列。 8.什么是蛋白质组学,什么是转录组学,简述这两个领域里最主要的研究手段 蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1995年提出的， 主要研究手段:包括双向凝胶电泳、等电聚焦、生物质谱分析及非凝胶技术。 转录组学(transcriptomics)，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。 主要研究手段:1)基于杂交技术的微阵列技术;2)基于Sanger测序法的 SAGE (serial analysis of gene expression)和MPSS(massively parallel signature sequencing);3)基于新一代高通量测序技术的转录组测序