食品中沙门氏菌检测1.doc

食品中沙门氏菌检测1.doc 食品中沙门氏菌检验 摘要: 本实验以鸡肠为材料制得样品匀液,按检测规定引用标准GB/T4789.4-2008对其进行沙门氏菌的检验.经过前增菌,选择性增菌,选择性平板分离,生化试验,血清学分型鉴定等步骤,得出25g样品中未检出沙门氏菌属的结论. 关键词:沙门氏菌 生化试验 血清学试验 选择性增菌 前言 沙门氏菌是肠杆菌科中一种重要的人畜共患病原菌，革兰氏阴性，是细菌性食物中毒的重要致病菌。血清型种类繁多，目前全世界已分离出2523 个血清型， [1].我国已发现216个。与人类疾病有关的血清型主要集中于 A~E 群，包括伤寒沙门氏菌、(甲、乙、丙型)副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。它不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒等动物疾病，还 [2]能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒。 根据国际惯例, 要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理, 以使大多数食物不含沙门氏菌, 从而有效预防沙门氏菌引发的各种疾病。20 世纪 50 年代以来, 国内外学者进行了大量的研究, 从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法, 并在实践检验中不断取得新进展。这些方法包括酶联免疫吸附试验法、免疫磁珠法、免疫荧光标记法、噬菌体裂解 [3]试验法、核酸探针法等。本实验采用的是传统标准检测方法，包括前增菌,选择性增菌,选择性平板分离,生化试验,血清学分型鉴定五个步骤。 1 材料与方法 1.1 设备和材料 1.1.1 恒温培养箱:36??1?，42??1? 1.1.2 拍击式均质器。 1.1.3 电子天平:感量0.1g。 1.1.4 无菌锥型瓶:容量500ml,250ml。 1.1.5 微量移液器及吸头。 1.1.6 无菌培养皿:直径90mm。 1.1.7 无菌试管:3mm×5mm、10mm×75mm。 1.1.8 无菌毛细管。 1.1.9 三角烧瓶。 1.2 培养基和试剂 1.2.1 缓冲蛋白胨水(BPW):称取蛋白胨10g，NaCl 5g，NaHPO12HO 9g，KH 24`22 PO1.5g,加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三瓶，121?，灭4 菌20min。 1.2.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:称取18.72g,加蒸馏水200ml，搅拌加 热煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，121?，灭菌20min，此上配 制的为基础液，冷却至50?，每100ml基础液加入碘液2ml，0.1%煌绿液 1ml，混匀备用。 1.2.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:称取4.6g，加蒸馏水200ml，搅拌加热 煮沸至完全溶解，分装试管，每管10ml，无需高压灭菌，冷却至常温立 即使用。 1.2.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:称取39.3g，加蒸馏水950ml，搅拌加热煮沸至完 全溶解，无需高压灭菌，为基础液;称取8g指示剂，加水50ml，水浴50? 左右，搅拌溶解，将50ml指示剂加入950ml已冷却到50?的基础液，混 匀后立即倾注平板。 1.2.5 HE(Hektoen Enteric)琼脂:称取牛肉膏5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g， 琼脂 20g，加蒸馏水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，冷 却到50?，立即倾注平板。 1.2.6 三糖铁(TSI)琼脂: 1.2.7 蛋白胨水、靛基质试剂: 1.2.8 尿素琼脂(PH7.2): 1.2.9 氰化钾(KCN)培养基及其对照氰化钾培养基: 1.2.10 赖氨酸脱羧酶试验培养基及其对照培养基: 1.2.11 甘露醇及山梨醇培养基: 1.2.12 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基: [4]1.3、检验程序 1.3.1 沙门氏菌检验程序见图1. 图 1 沙门氏菌检验程序 1.3.2操作步骤 1.3.2.1培养基的配制 按照1.2的部分配制。 1.3.2.2前增菌 称取25g样品放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1~2min。样品为液态，直接进行培养，于36??1?培养8h~18h。 1.3.2.3选择性增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10mlTTB培养基内;于42??1?,18h~24h培养。 另取1ml,转种于10mlSC内，于36??1?,18h~24h培养。 1.3.2.4 选择性平板分离 分别用接种环取经TTB增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。同时，另取SC增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。于36??1?分别培养18h~24h(HE琼脂平板)或40h~48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见1 表 1 沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 菌落为黑色有金色光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈 BS琼脂 黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为 HE琼脂 黄色，中心黑色或几乎全黑色 1.3.2.5 生化试验 1.3.2.5.1扩培典型或可以菌落 自选择性琼脂平板上挑取一个典型或可以菌落，营养琼脂平板，与36??1?培养18h~24h，必要时可延长至48h。得到纯培养。 1.3.2.5.2接种生化培养基 将营养琼脂平板上的纯培养物接种三糖铁琼脂，现在先在斜面划线，在于底层穿刺;接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基。赖氨酸脱羧酶实验要同时接种试验管和对照管。 同时，可直接接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素琼脂(pH 7.2)、氰化钾(KCN)培养基、甘露醇和山梨醇试验。 所有试管于36??1?培养18h~24h氰化钾必要时可延长至48h，将已挑菌落的平板储存于2?~5?或室温至少保留24h，以备必要时复查。 1.3.2.5.3结果观察与判断 1.3.2.5.3.1通过TSI和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断，反应结果见表2 表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试初步判断 验培养基 斜面 底层 产气 硫化氢 - + +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 - + +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属 + + +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 + + +/- +/- - 非沙门氏菌 注:+阳性，-阴性;+(-)多数阳性，少数阴性;+/-阳性或阴性 表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也有不是沙门氏菌属的可能。 注:TSI结果判定方法:斜面黄色为+，红色为-;底层黄色为+，红色为-;产气可以观察培养基内的气孔;硫化氢的判断是培养基转黑色为+，黄色为-，入试管地步全部为黑色可以判断底层为+。 赖氨酸脱羧酶试验试管为蓝绿色，对照变黄为阳性，试验管和对照管均变黄为阴性。 1.3.2.5.3.2通过TSI反应中的H2S、靛基质试验、尿素琼脂(pH 7.2)、KCN实验结果，查表3将可疑反应分为A1、A2、A3。 表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢靛基质 pH 7.2尿素 氰化钾赖氨酸脱羧 (H2S) (KCN) 酶 A1 + - - - + A2 + + - - + A3 - - - - +/- 注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性 注:靛基质试验在培养后加靛基质试剂2~3滴，立即观察，表面为红色为阳性，不变色为阴性;尿素实验结果为桃红色是阳性，淡橙红色是阴性;氰化钾浑浊， 有菌生长为阳性，反之为阴性。 1.3.2.5.3.3反应系列号A1:典型反应为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有一项异常，按表4可判断为沙门氏菌属。如2项异常为非沙门氏菌属。 表4沙门氏菌属生化反应初步鉴定表 pH 7.2尿素 氰化钾赖氨酸脱羧判定结果 (KCN) 酶 - - - 甲型副伤寒沙门氏菌属(要求血清学 鉴定结果) - + + 沙门氏菌IV或V(要求符合本群生化 特征) + - + 沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定 结果) 注:+阳性;-阴性 1.3.2.5.3.4反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇实验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 甘露醇和山梨醇实验结果为黄色是阳性，紫色是阴性。 1.3.2.5.3.5反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 1.3.2.5.3.6 API20E生化鉴定试剂盒 如选择API20E生化鉴定试剂盒可根据表2的初步判定结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用API生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。 1.3.2.6血清学鉴定 1.3.2.6.1抗原的准备 一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集实验用的抗原。本次试验采用扩大培养营养琼脂平皿上的菌落做实验。 1.3.2.6.2多价菌体抗原(O)鉴定 在玻片上画出两个约1cmX2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上 的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 2 结果与 2.1样品在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果如下表 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试初步判断 验培养基 斜面 底层 产气 硫化氢 - + +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属 结果显示有沙门氏菌属的可能，同时也有不是沙门氏菌属的可能。 2.2样品生化反应结果如下表 硫化氢靛基质 pH 7.2尿素 氰化钾赖氨酸脱羧(H2S) (KCN) 酶 + + - - + 结果符合序列A2，补做甘露醇和山梨醇实验。结果显示，甘露醇和山梨醇实验结果为紫色，是阴性。 2.3血清学鉴定结果 经过多价菌体抗原(O)鉴定，样液没有凝集现象，结果是阴性。 3 结论与讨论 实验结果显示，25g样品中未检出沙门氏菌属。为了提高沙门氏菌属检出率，可以对增菌液进行改良。根据谢开森的研究，将亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液作如下改良能达到目的:在成分中添加4g麦芽糖作为供应沙门氏菌属生长的碳源 [5]并增加磷酸二氢钾0.5g，谷氨酸0.5g，对氨基苯甲酸0.1g，最终的pH为7.2。 参考文献 [1]刘华伟,郭蔼光,马立农,等.PCR技术在沙门氏菌快速检测中的运用[J].动物医学进展，2004，25(6):55-58 [2]付丽红，王晓闻.酶联免疫吸附法在沙门氏菌检测中的研究进展[J].中国酿 造,2009,1:1-3 [3]张鲁.食品中沙门氏菌检测方法的探讨[J].安徽农业科学,2008,36(2):569-570 [4]中华人民共和国国家标准—食品卫生检验方法(微生物部分) GB4789.4-2008 [5]谢开森.改进亚硒酸盐胱氨酸培养基提高检出沙门氏菌属带菌者[J].中国卫生检验杂志,1995,5(5):306