免疫学诊断技术6

null医疗器械基础知识及免疫学诊断技术 医疗器械基础知识及免疫学诊断技术 济南卓冠生物技术有限公司目录目录医疗器械基础知识 体外诊断试剂分类 胶体金技术简介 酶联免疫技术简介 一 医疗器械基础知识一 医疗器械基础知识1、《医疗器械监督管理》于1999年12月28日国务院第24次常务会议通过，2000年4月1日起施行。 2、医疗器械：医疗器械是指单独或者组合适用于人体的仪器、设备、器具、材料或者其他物品，包括所需要的软件；其用于人体体表及体内的作用不是用药理学、免疫学或者新陈代谢的搜段获得，但是可能有这些手段参与并起一定的辅助作用； 其使用旨在达到下列预期目的： （1）对疾病的预防、诊断、治疗、监护、缓解 ； （2）对损伤或者残疾的诊断、治疗、监护、缓解、补偿； （3）对解剖或者生理过程的研究、替代、调节； （4）妊娠控制。1.1医疗器械分类1.1医疗器械分类医疗器械按照其医疗器械分类判定的依据 （一）医疗器械依据其结构特征分为：有源器械和无源器械。 （二）根据不同的预期目的，可将医疗器械归入一定的使用形式。 无源器械的使用形式有：医用敷料；外科器械；重复使用外科器械；一次性无菌器械；植入器械；护理器械、体外诊断试剂、其他无源接触或无源辅助器械等。 有源器械的使用形式有：诊断监护器械；输送体液器械；实验室仪器设备、医疗消毒设备；其他有源器械或有源辅助器械等。 （三）根据使用中对人体产生损伤的可能性、对医疗效果的影响，医疗器械使用状况可分为接触或进入人体器械和非接触人体器械。 根据医疗器械的危险性： 第一类是指，通过常规管理足以保证其安全性、有效性的医疗器械； 第二类是指，对其安全性、有效性应当加以控制的医疗器械； 第三类是指，用于支持、维持生命；对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制的医疗器械。1.2医疗器械生产企业应当符合下列条件： 1.2医疗器械生产企业应当符合下列条件： 具有与其生产的医疗器械相适应的专业技术人员； 具有与其生产的医疗器械相适应的生产场地及环境； 具有与其生产的医疗器械相适应的生产设备； 具有对其生产的医疗器械产品进行质量检验的机构或者人员及检验设备。1.3医疗器械经营企业应当符合下列条件 1.3医疗器械经营企业应当符合下列条件 具有与其经营的医疗器械相适应的经营场地及环境； 具有与其经营的医疗器械相适应的质量检验人员； 具有与其经营的医疗器械产品相适应的技术培训、维修等售后服务能力。 二 体外诊断试剂 2.1 定义 二 体外诊断试剂 2.1 定义 体外诊断（IVD，In Vitro Diagnosis）试剂，包括可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，在人体之外通过对人体的样本（如血液、体液、组织等）进行检测而获取临床诊断信息的产品和服务，包括仪器、试剂、校准品、质控品等。原理是通过试剂和体内物质在体外的反应强度或速度来判断体内物质的性质和数量，通过和品的比较来判断人体的生理状态。null1.临床生化试剂： 用化学方法使样本产生变化，通过测吸光度，波长及颜色反应等进行疾病的诊断、治疗和监控； 2.免疫诊断试剂：免疫生物学发展很快，利用抗原和抗体的特异性反应的原理进行疾病的诊断； 2.2 体外诊断试剂的分类null 3.分子诊断试剂： 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。 4.功能检测试剂：如血凝试剂，看凝血状态是否正常。 5.其他：细胞染色切片，镜像等 2.3 免疫学诊断试剂的类型2.3 免疫学诊断试剂的类型1.按方法分为间接免疫学试剂和直接免疫学试剂（如双抗体夹心法，双抗原夹心法，间接法，竞争法等）； 2.按示踪剂分为放射免疫法，酶联免疫法，荧光法，化学发光法，胶体金法，乳胶法等；三 胶体金技术简介 免疫层析胶体金技术是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式,该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相,通过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动,并同时使样品中经标记物标记的待测物与包被在层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生高特异、高亲和性的免疫。三 胶体金技术简介1 胶体金标记技术的相关定义1 胶体金标记技术的相关定义1.1 定义 免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。 胶体金标记 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理一般认为是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。null胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。 1.2 透射电镜下观察金颗粒的形状 1.2 透射电镜下观察金颗粒的形状劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 2 胶体金的制备2 胶体金的制备量取200ml超纯水，加热至沸腾，并保持微沸。加入15ml1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟。加入1%的氯金酸5ml,继续煮沸，待颜色有变化后计时，煮沸10min。停止搅拌，冷却至室温。 2.1胶体金粒径的大小与还原剂的量有关系 2.1胶体金粒径的大小与还原剂的量有关系 粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同。 1％柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙 吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518 径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15 3.制备高质量胶体金的注意事项 3.制备高质量胶体金的注意事项 （1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。 4 胶体金技术的种类及特点 4 胶体金技术的种类及特点 4.1 快速免疫金渗滤法 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体 。null斑点金免疫渗滤null 4.2 免疫层析法 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 null衬板样品垫金标垫吸收垫膜胶体金免疫层析试纸条的构成 双抗体夹心法 双抗体夹心法标本Goldtestcontrol竞争法竞争法标本标准抗原Goldtestcontrol 其检测原理与上述的其它方法有所不同：胶体金颗粒标记单克隆抗体，而检测线包被小分子抗原，质控线包被抗鼠IgG。检测时，样本中的待检抗原首先与金标抗体结合，上行到达检测带时，如待检抗原把一定量的抗体完全饱和，则金标抗体将不能与检测带的抗原结合，不会出现肉眼可见的红色条带，为阳性结果。如标本中无待检抗原，则金标抗体与检测带的抗原结合，形成红色条带，为阴性结果。 选用该方法应特别注意胶体金颗粒的抗体吸附量及包被抗原量。 间接法间接法双抗体夹心法为例双抗体夹心法为例测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。 若标本中有待测特异抗原，即可与免疫金复合物中的抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体捕获，在膜上显出红色反应线条（T）。 过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。 阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。4.2.1 结果判定图示——卡型4.2.1 结果判定图示——卡型4.2.2 结果判定图示——条型4.2.2 结果判定图示——条型4.2.3 结果判定说明4.2.3 结果判定说明阳性结果：出现质控线和反应线两条紫红色线，实验结果为阳性。 阴性结果：仅出现一条紫红色质控线，实验结果为阴性。 无效：不出现质控线红线或仅出现一条反应线红线，实验结果为无效结果，应重试。 竞争法的结果判定则相反5 免疫胶体金技术的特点5 免疫胶体金技术的特点简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。 结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。 特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。null6 胶体金技术的应用 7 相关仪器 喷膜仪 7 相关仪器 喷膜仪 仪器参数 仪器尺寸为： 430mmx410mmX360mm 平台大小: 450mmX70mm 平台移动速度: 0-330mm/sec X、Y、Z轴移动误差: <50um 定位精度: ±10um in 1 axis;±25um in 2 axis 喷点方式 BJQ3000: 非接触喷点 AJQ3000: 非接触喷点 划线宽度 BJQ3000:0.50mm/line （喷点0.20mm/drop） AJQ3000: 0.5-5mm 最小喷量 BJQ3000:10nl/drop AJQ3000:1ul/cm 划线精密度 BJQ3000:±1% AJQ3000: ±2% 切条机切条机仪器参数: 进料宽度：≤100 mm 进料长度：不限,可连续进料切割 切割宽度：≥1 mm, 宽度连续可调 切割宽度设定位数：0.01 mm 切割精度：±0.1 mm 切割速度：230次/分钟, 速度连续可调 切条计数：单次工作和总工作分别计数 刀片: 日本进口, 耐磨高碳钢材料 抗静电装置：建议选配 电源：220VAC 重量：20KG 尺寸：430(L)×330(W)×260(H) mmnull 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）四 酶联免疫检测（ELISA)技术简介 1. ELISA的原理 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，特异性强。null2　ELISA的类型2.1 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。 null2.2 双抗体夹心法测抗原反应原理和模式与双抗原夹心法类似。用特异性抗体进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗原。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗体代替酶标抗抗体。null2.3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（二抗）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 。null2.4 竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。null2.5 捕获法测IgM抗体 3 ELISA的试剂制备及操作 以双抗体夹心法为例 null获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定null4.特点 4.1　特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 4.2 灵敏度4.2 灵敏度 该测定法的灵敏度来自酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 null5 结果判断 5.1定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。null5.2 定量测定ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。 null6.ELISA的应用1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位 2、研究抗酶体 3、显现微量的免疫沉淀反应 4、定量检测体液中抗原或抗体成份THANKS AND BLESSINGTHANKS AND BLESSING