【doc】生物芯片技术在眼科的应用

【doc】生物芯片技术在眼科的应用 生物芯片技术在眼科的应用 \外7fr 生物芯片技术在眼科的应用 解放军总医院眼科 陈学国综述何守志审校 摘要:生物芯片技术是近几年来生命科学领域中发展起来的一项新技术,以其检测的快速,高效, 高通量,高度并行性,微型化和自动化等特点一经出现即成为生命科学领域研究的热点.目前已成为研 究生命本质及疾病发生发展规律的重要手段,生物芯片技术在眼科疾病研究中也颇受关注.本文对生 物芯片技术的基本概念,分类,特点,基本原理及其在眼科疾病研究中的应用前景作一综述. 一 ,生物芯片概述 生物芯片技术是随着人类基因组 (HGP)的研究发展应运而生的,是近几年发展 起来的一项新兴生物技术.它将生命科学研究 中所涉及的许多步骤,利用微电子,微机 械,化学,物理技术,计算机技术,使样品检测, 分析过程连续化,集成化,微型化.它将大量探 针分子固定于支持物上(通常支持物上的一个 点代一种分子探针),并与标记的样品杂交或 反应,通过自动化仪器检测杂交或反应信号的 强度而判断样品中靶分子的数量.由于该技术 可将大量的生物分子(DNA,RNA,抗体,酶,蛋 白等)作为探针固定于支持物(塑料,玻璃等)表 面上,且每一种分子或几种分子探针代表一种 病原体或疾病(如:各种肿瘤,自身免疫及内分 泌疾病),从而解决了快速,微量,准确地诊断疾 病了解病情的要求【1--2]. 生物芯片技术的基本原理是分子杂交.类 似于Southern和Northern印迹杂交技术,通过 探针与固定于芯片上的大量eDNA,EST或寡 核苷酸的杂交来实现【2]2.具体来讲,就是在芯 片上按照特定的排列方式固定大量的靶基因, 形成一种微阵列.将样品DNA或RNA通过 PCR或RT-PCR扩增,体外反转录等技术掺入 荧光标记分子后,与位于芯片上的靶基因杂交, 最后通过荧光扫描仪及计算机综合分析后即可 获得样品中大量基因序列及表达的信息. 生物芯片的分类: (一)根据探针分子种类划分 1.基因芯片(又称DNA芯片,DNA阵列, DNA微阵列,寡核苷酸阵列等):探针分子为单 链基因级DNA或mRNA反转录的eDNA,这 种探针分子一般为某种病原体或组织所特有 的.其具有稳定,点密度较高,探针分子对疾病 的针对性强等特点2]. 2.寡聚核苷酸芯片:探针分子为寡聚核苷 酸,主要用于病原体的分类,基因的突变检测. 3.肽,蛋白芯片:探针分子为多肽或蛋白 包括酶,抗体,受体等.该不仅适合于抗 原,抗体的筛选,同样也可用于受体配体的相互 作用的研究.但其稳定性,重复性问题较突 出[3l. (二)根据支持介质划分 制备芯片的固相介质有玻片,硅片,聚丙烯 酰胺凝胶,尼龙膜等.在选择固相介质时,应考 虑其荧光背景的大小,化学稳定性,结构复杂 性,介质对化学修饰作用的反应,介质表面积及 其承载能力以及非特异吸附的程度等因素.目 国外医学眼科学分册2003年第27卷,第5期:257-261—257— 前较为常用的支持介质是玻片. (三)根据制备方法划分 芯片制备的方法主要有原位合成与合成点 样.其中原位合成又可分为光引导聚合法和喷 墨打印合成法.光引导聚合法在合成前需先对 介质进行处理,使之衍生出羟基或氨基并与光 敏保护基建立共价连接,合成单体的一端用固 相合成法化,另一端与光敏保护基相连.在合 成反应过程中,通过蔽光膜使特定的位点透光, 其余点不透光,只有受光的位点才能脱掉保护 基并与特定单体活化端相连,单体的光敏保护 端露出,经过若干上述循环反应后,使每个位点 按需要合成特定序列的探针,其中每次合成反 应中哪些位点上连接哪种单体,由更换不同的 蔽光膜来控制5.喷墨打印合成法的原理类 似于喷墨打印机,通过4个喷印头将4种碱基 按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上.合 成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点 到介质上,点样前需将介质表面包被氨基硅烷 或多聚赖氨酸,使之带上正电荷来吸附核酸分 子.除上述方法外,还有用聚丙烯酰凝胶作为 支持介质,制成以凝胶块为阵点的芯片6.其 基本原理是在硅片上镀一层500nm厚的金层, 通过蚀刻技术在硅片上形成金微电极,吡咯单 体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜,其 中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中 连到电极上,每钟探针的位置通过特定电极的 开启与关闭来控制[7,8].Ferguson等[9]还利用 光纤束建立了光纤生物传感微阵列.基因芯片 从本质上讲与Southernblot和Northernblot相 同,只是许多探针(可以是同种分子或不同种分 子)同时固定在同一芯片上,在相同的实验条件 下,同时完成多种不同分子的检测[10-13].因而 它与传统的杂交法相比具有操作简单,快速,高 效,自动化程度高,检测靶分子种类多,高度并 行性,高度敏感性,成本低,结果客观性强等优 点.自发展伊始已广泛应用于生命科学的各个 领域,并已用于基因功能各方面的研究.如基 因差异表达的检测,基因表达谱的分析,测序分 析,基因分型,遗传作图,基因突变,疾病诊断, 一 258一 药物筛选以及新基因寻找等,同时在微生物菌 种鉴定及致病机制中发挥作用. 二,生物芯片技术在眼科的应用 (一)在角膜研究中的应用 Gottsch等【l4J从眼库正常角膜的角膜内皮 中提取总RNA,创建eDNA文库,然后与含有 12558种探针的微阵列进行杂交.结果5种表 达最多的基因表达序列标签(EST)分别是细胞 色素C氧化酶?,三磷酸腺苷合成酶F6,碳酸 酐酶?,12S核糖体RNA,重铁蛋白多肽1.证 实了许多内皮细胞泵功能酶,它们包括Na/ K-ATP酶,碳酸氢盐输送器等.Gottsch 等【15J将Fuehs病角膜内皮与正常角膜内皮进 行比较后发现Fuehs病患者的角膜内皮细胞中 线粒体的基因表达,泵功能基因的表达和抗凋 亡细胞基因的表达均降低.Yamagami等[16J用 致炎细胞因子刺激人角膜内皮细胞后进行微阵 列分析发现,表达上调最多的基因是MCP一1, IL-8,IL-6和GRO-t3.致炎细胞因子刺激使细 胞因子和化学增活素在人角膜内皮细胞中高效 表达.Cao等l17J用准分子激光消融鼠角膜上 皮,从正常和愈合的角膜中提取总RNA进行 杂交,结果表明1176种尼龙阵列的基因中,在 愈合的角膜中有37种基因表达上调,27种基 因表达下调.上调的基因是细胞间黏附分子 (IC)一1,巨噬细胞反应性蛋白,细胞因子信 号蛋白抑制剂(SOCS)和IL-10受体等.下调 的基因是连接蛋白一31,ZO-1和Smad2等. Mahajan等It8J用白细胞介素一1a处理培养的人 角膜纤维母细胞后提取RNA,进行DNA微阵 列分析,结果表明化学增活素,基质分子,膜受 体,血管生成介质和转录因子与炎症反应的病 理生理有关.Varela等【19J用微阵列技术研究 PRK术后兔角膜基因表达谱的变化.与对照 组相比,术后3天有70种基因表达相差3倍或 者更多,其中42种基因增加3倍或者更多,28 种基因表达下降3倍或者更多.术后7天,只 有27种基因表达相差3倍,其中20种基因表 达上调,7种表达下调.Lee等[20]将培养的人 角膜上皮细胞用25ng/ml的EGF,25ng/ml的 HGF,25ng/ml的KGF分别处理8小时.从 HCE细胞中分离提取总RNA合成eDNA探 针,然后将探针与Atlas人细胞周期和分化微 阵列进行杂交.发现调控上皮细胞的细胞因子 对细胞的周期和分化有相似的影响,E(,HGF 和KGF对角膜上皮细胞的细胞周期和分化有 关的基因表达有不同的影响,所有的促进有丝 分裂的三种生长因子,上调培养的人角膜上皮 细胞中细胞周期蛋白D1和丝氨酸及苏氨酸蛋 白激酶PITALRE的基因表达.Jun等[21]用人 角膜创建eDNA文库,与含有5600种人基因的 微阵列进行杂交,证实在人角膜中有1200种基 因表达,表现了6种胶原蛋白基因在角膜中有 表达.证实了5种与凋亡有关的基因,其中有 4种在角膜中是未知基因. (二)在青光限研究中的应用 wirtz[22]等通过培养年轻人小梁网细胞, 进行微阵列分析表明,人小梁网表达最多的基 因是铁蛋白H,真核转录延长因子1一a,铁蛋白 L,纤维连接蛋白和组织基质金属蛋白酶抑制 剂一1.Ishibashi等[23]用地塞米松处理培养的 人小梁网细胞,七天后从提取的总RNA中合 成带有标记的eDNA探针,并且与包含2400种 基因的人eDNA基因芯片进行杂交,结果表明 应用地塞米松处理的人小梁网细胞中,有30种 基因呈双倍表达.在这30种基因中,核心蛋白 多糖,胰岛素样生长因子结合蛋白2,铁蛋白L 是上调表达最多的基因.同时发现有34种基 因表达下调.Hernandez等[24]利用微阵列技术 比较培养的人青光眼和正常眼视乳头的星形胶 质细胞基因表达的差异,发现培养的青光眼视 乳头星形胶质细胞中有150种基因表达超过正 常眼视乳头的星形胶质细胞基因表达的5倍. 这些超表达的基因与生物学进程密切相关,包 括信号转导,细胞黏附和增殖,ECM合成和降 解等. (--)在晶状体研究中的应用 Spector等[]将培养的晶状体上皮细胞放 入到125MM的H202(H细胞)或100MM三丁 基过氧化氢(3)和125MM的H202混合 液中(HT细胞).从不同的细胞系中提取总 RNA,对照组,H细胞组和}rr细胞组用含有 12422种基因的基因芯片进行分析,大约有950 种(7.6%)基因表达有显着改变.发现了一小 组抗氧化防御系统基因,包括过氧化氢酶,谷胱 甘肽一转移酶家族成员,NADHADI)H维生 素l氧化还原酶1和铁蛋白L.Chauhan 等[26]使用含有9700个基因的eDNA微阵列来 鉴定三种相关系统(Pax6异基因晶状体,Pax6 异基因眼和PaX6过高表达的转基因晶状体). 他们得出的结论是,Pax6基因在晶状体生长和 维护中起着重要作用. (四)在视网膜研究中的应用 Li等[27]为了探讨视黄酸(RA)诱导的视锥 细胞抑素的基因调节通路,在培养的Weri—Rb- 1视网膜母细胞瘤的细胞中,一组加入视黄酸, 另一组不加入视黄酸做对照.用含有6800种 基因的DNA微阵列分析,结果表明视黄酸能 诱导视锥细胞特有的基因表达上调;视杆细胞 特有的基因表达下调.RA处理能使处于Gn 或Gl期的细胞停止发育,增加人视锥细胞 (hCAR)免疫活性和凋亡细胞的数量,下调细 胞周期蛋白(细胞周期蛋白一E和细胞周期蛋白 D3)和细胞周期蛋白依赖性致活酶(C[)K5, <10)等关键基因的表达.Lenzner等[28]比 较Ndp敲除的鼠与野生型鼠基因表达差异,结 果表明,在Ndp敲除的鼠基因转录缺乏或基因 转录下调是光感受器细胞所特有的.而在年轻 的(一岁内)Ndp敲除的鼠所有的这些转录呈现 正常水平表达.Yoshida等【29]将含有2400种 人基因的微阵列载玻片与生物素或二硝基酚 (DNP)标记的靶c亡INA与从人视网膜提取的总 RNA进行杂交,结果表明在含有2400种基因 的载玻片中,多于50%基因与视网膜eDNA发 生杂交.这些表达的大多数基因不随年龄而改 变.发生基因差异表达的基因有24种,这些基 因分为4组:司能量代谢,应激反应,细胞生长 和神经或信号传递.得出的结论是,人视网膜 老化与基因表达模式的改变有关,与应激反应 和能量代谢有关的通路在视网膜老化过程中起 一 259— 着关键作用.Singh等【圳将从损伤的人视网膜 色素上皮提取的一19细胞作为实验组,未 损伤组作为对照组.在损伤修复的增殖期,从 对照组和损伤组提取总RNA.合成32PdATP 标记的eDNA探针并且与包含588种eDNA的 Atlas微阵列进行杂交.结果显示损伤细胞的 基因编码DNA合成和DNA修复蛋白上调表 达比对照组高出6倍.他们认为RPE可能较 早地参与了增殖性玻璃体视网膜病变的炎症反 应.Wistow等【31J用人视网膜和脉络膜创建的 eDNA文库,得出的结果是,最丰富的转录来源 于11号染色体BBS1区域.大量首选转录的 组织与视网膜,脉络膜和虹膜组织相似.Bu— raczynska等[32J从人视网膜色素上皮分离的 RNA创建两种eDNA文库(一种扩增,另一种 不扩增),从两种文库中随机选取克隆产物获得 5'末端序列.在这些序列中,多于2000种 (Esr)与公共数据库中的序列和基因族相似. EST证实了已知的RPE表达基因和500多种 在其它组织中表达但不知道在RPE中表达的 基因.甲状腺运载蛋白和90Kda热休克蛋白 在这些文库中转录最多.证实了200多种新的 EST和推测的蛋白.Joussen等[33]使用链脲霉 素制成Long-Evans鼠模型,高密度eDNA阵列 分析视网膜的基因表达,显示视网膜对糖尿病 的反应包含有炎症成分,而且许多调节活性发 生在糖尿病的第一周. (五)其它方面的作用 Hill等【34J将感染有HSV-I实验组和未感 染HsV—I对照组大鼠放入43?的环境下10 分钟,另外两组是感染有HSV-I和未感染 HSV-工的大鼠但不进行热应激.结果显示感 染有HSV-I实验组增加了早期应激基因的表 达,包括两种热休克蛋白(HsP60和HSP40), 一 种基本转录因子(BTFT62),一种DNA修复 酶,两种致活酶(MAP致活酶和应激性蛋白激 酶),一种氧化应激诱导蛋白,一种二氧化锰超 氧化物歧化酶一2和环氧化酶一2.Dorrell等[35] 为了研究内皮细胞引起血管形成的机制,使用 新生大鼠视网膜模型,用胶原蛋白?免疫组化 一 260一 和印染分析出生后和胚胎期不同时期的视网膜 血管形成,认为视网膜血管的发生发展可能与 中枢和周围神经系统神经元的发生发展有许多 相同的机制.Oh等[36J利用微阵列技术研究 VEGF引起血管形成的机制,发现VEGF不仅 能直接激活内皮细胞,而且还能在体内通过上 调它的同源受体的表达来增强血管形成. 三,展望 目前,眼科领域许多疾病的病因,发病机制 仍不十分清楚,生物芯片技术作为一个技术平 台,无疑有助于对眼科疾病更深一步的理解. 可为各种眼病的病因,临床预后判断及治疗方 案的选择提供理论指导.基因芯片技术能够对 微量样本中的核酸序列信息进行快速,高通量 和低成本检测和分析,特别是其大通量并行化 采集生物信息的特点,是目前其它分析技术所 无法相比的.其研究和应用必将带动眼科学研 究的整体进步,大大推动眼科学的发展.尽管 生物芯片技术在我国起步较晚,但潜力较大, 以此作为突破口,将生物芯片技术应用于眼病 研究一定能够取得令人瞩目的成绩.随着该技 术的不断完善与发展,在将来,无论是基因芯片 还是蛋白芯片都会作为一种简便快捷的技术, 为我们的研究工作与临床检测带来极大的便 利. 参考文献 1EdwinSeta1.NatureGeneticsSupplement,1999;21: 5 2ChengJeta1.MolecularDiagnosis,1996;1:183 3LemieuXeta1.MolecBreeding,1998;4:277 4LuekingAeta1.AnalBiochem.1I9;270:. 103 5PeaseACeta1.ProcNatlAcadSciUSA,1994;91: 5022 6YershovGoeta1.ProcNatlAcadSciUSA,1996;93: 4913 7LivacheTeta1.ClinChinaActa,1998;278:171 8LivacheTeta1.AnalBiochem,1998;255:188 9FergusonJAeta1.NatBiotechnol,1996;14:1681 10SchenaMeta1.Science,1995;270:467 11GuschinDetal.AnalBiochem,1997;250:203 12BormanS.ChemEn4gNews,1996;74:42 13ChengJeta1.MolDiagn,1996;1:183 14GottschJDeta1.ArchOphthalmol,2003;121-252 15GottschJDeta1.InvestOphthalmol?SSci,2003; 44:594 16YamagamiHeta1.InvestOphthalmolVSci,2003; 44:514 17CaoZeta1.InvestOphthalmol?sSd,2002;43: 2897 18MahajanvBeta1.InvestOphthah~l?sSci,2002; 43:2143 19VarelaJCeta1.InvestOphthalmol?sSci,2002;43: 1772 20LeeJSeta1.CurrEyeRes.2001;23:69 21JunASeta1.ArchOphthalmol,2001;119:1629 22WinzMKeta1.InvestOphthalmolVisSci,2002; 43:3698 23IshibashiTeta1.InvestOphthalmolVISSd,2o02; 43:3691 24HemandezMReta1.Glia,2002;38:45 25SpectorAeta1.InvestOphthalmol?sSci,2002;43: 3251 26ChauhanBI(eta1.JB|olChern.2002;277:11539 27LiAeta1.InvestOphthalmolVISSci.2o03;44:996 28LenznerSeta1.InvestOphthalmolVisSci,2002; 43:2825 29YoshidaSeta1.InvestOphthalmolVisSci,2002; 43-2554 30SinghSeta1.GradesArchClinExpOphthalmo1. 2001;239:946 31WistowGeta1.MolVis,2002;8:205 32BuraczynskaMeta1.InvestOphth~olVSci. 2o02:43:603 33Jou~mAMeta1.InvestOphthalmolVSd,2001; 42:3047 34Hi11JMeta1.VirusGenes.2001;23:273 35DorreUMIeta1.InvestOphthalmolVISSci,2002; 43:3500 360hHeta1.ProcNatlAcadSdUSA.2O02;99-383 功能性磁共振成像在视觉研究中的应用 天津医科大学 刘虎综述 天津眼科医院 赵堪兴审校 摘要:fMRI是利用磁共振成像技术探测大脑在不同条件及不同区域与神经活动相关生理变化的 实验方法.它可以无损伤,直观地反映活体大脑功能,是研究与脑功能相关视觉系统问题的一项新技 术.本文对fMRI的基本原理,技术特点及其在视知觉领域的应用作一综述. 功能性磁共振成像(fMRI)是近年来神经(BoLD对比度),即时探测大脑在不同条件及 影像医学发展的一项新技术.与既往脑功能研不同区域与神经活动相关的生理变化,对脑组 究(脑电图,诱发电位及正电子发射成像)不同,织进行实时功能成像LlJ. fMRI以血一氧水平相关效应(舢)为核心直众所周知,神经活动与血氧消耗密切相关. 接检测和定位脑功能,实现了人类长期以来无皮层神经元兴奋时,由于耗氧量增大,在自身调 损伤具体观察活体大脑功能的梦想.研究表节的作用下,毛细血管开放,管腔增大,血流加 明,fMRI不仅使影像医学发生了巨大的变化,快,神经元兴奋区域的氧合血红蛋白随之增多. 而且对脑科学尤其是认知领域的研究产生了深即:神经元兴奋时,局部区域血红蛋白含氧量经 刻影响.本文就fMRI的基本原理及其在视知历了一个动态变化过程.进一步研究证实,血 觉领域的应用作一综述.红蛋白在携氧与不携氧时磁性不同,对磁场影 一 ,tMRI基本原理与特点响亦不相同.当血红蛋白不携氧时,在磁场中 fMRI基本原理是以BOLD效应为基础,呈顺磁性,可显着增加磁场强度,降低磁共振信 利用磁共振技术检测血液中的含氧浓度号;反之,当血红蛋白携氧时,在磁场中呈抗磁 国外医学眼科学分册2003年第27卷,第5期:261,265—261—