dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5达的实验研究 摘要：目的  观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法  将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting 检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达，0.5%锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果  200~300 nmol/L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达，而50~200 nmol/L浓度的dsRNA有利于干细胞存活。结论  dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。 关键词：双链RNA；Hes5；神经干细胞，骨髓源性；RNA干涉；免疫印迹 Blocking with double- stranded RNA of the expression of Hes5 in rat bone marrow-derived neural stem cells WANG Hai-yan1； XU Ru-xiang1； JIANG Xiao-dan1； LUO Shen-qiu2 1Institute of Neuromedicine of PLA, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282,China; 2Department of Cellular Biology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China Abstract: Objective  To examine the efficiency of exogenous small double-stranded RNA (dsRNA) in knocking down the gene expression at the post-transcription level, and investigate the factors that may influence the transfection. Method  The bone marrow stromal cells of SD rat were separated and cultured in vitro, followed by induction of the cells to evolve into neural stem cells using special culture medium prepared by our laboratory. Synthetic dsRNA was then transferred into the cells at varied concentrations, and the results were analyzed by Western blotting. Results  The concentrations ranging from 200 to 300 nmol/L were optimal for specifically blocking the expression of Hes5, whereas the suitable concentrations for the cell survival were between 50 and 200 nmol/L. Conclusion  dsRNA is capable of triggering RNA interference in neural stem cells, and at appropriate concentration, it may specifically and effectively knock down endogenous gene expression without sacrificing the viability of the cells. Key words: double-stranded RNA; hairy and enhancer of split; neural stem cell, bone marrow-derived; RNA interference; Western blotting 收稿日期：2003-07-11 基金项目：国家自然科学基金(3027049)；军队及广东省科技厅“十五”重大项目(01z054) The study is supported by National Natural Science Foundation of China (3027049), and is a key project of the Tenth Five-year Plan of the PLA and Science and Technology Commission of Guangdong Province 作者简介：王海燕(1972-)，女，第一军医大学在读硕士研究生，电话：020-61642620，E-mail: haiyanwang838@msn.com     RNA干涉(RNA interference, RNAi)是一种转录后水平的基因沉默，作为关闭特定基因功能的新技术，为研究特定基因功能提供了一种快速、简便的方法，其特点是当外源性短双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)进入细胞后，能高效的降解同源的mRNA，从而抑制相应基因的表达。尽管RNAi在非哺乳动物细胞和部分哺乳动物细胞系如Hela、HEK293和P19中能有效发挥作用，RNAi在骨髓源性神经干细胞内是否能有效短暂地降解目的基因在蛋白水平的表达，目前还不清楚。为此，本实验通过体外分离培养SD大鼠骨髓基质细胞，经本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，然后应用人工合成的dsRNA转染神经干细胞，观察dsRNA是否能阻断Hes5 (hairy and enhancer of split)——一个特定表达于神经干细胞的Notch信号通路下游基因的表达，并对其相应的机制进行初步探讨。      1  材料和方法     1.1  实验动物与材料     6月龄健康成体SD大鼠，体质量130 g，由第一军医大学实验动物中心提供。神经干细胞培养液由本实验室配制(专利申请中)。细胞分离液(CSM)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、L-谷胺酰胺、胰蛋白酶、脑源性神经生长因子(BDNF)均购自Sigma公司。胎牛血清购于杭州四季青生物材料研究所。细胞裂解液、生物素化羊抗小鼠IgG及链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物购自上海申能博彩生物科技有限公司。Hes5抗体及Nestin抗体购自chemicon公司，Hes5基因的dsRNA设计后交德国proligo公司合成，HRP标记的兔抗大鼠IgG、生物素化羊抗小鼠IgG、链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物及化学发光检测试剂购自武汉博士德生物有限公司。     1.2  骨髓基质细胞的分离及培养成神经干细胞     将大鼠处死后取出股骨，用注射器吸取1.5 ml PBS和1.5 ml肝素钠盐水(125 U/ml)，从骨的一端缓慢地冲洗骨髓腔。将所得的细胞悬液进行密度梯度离心，取单核细胞层(云雾状层)，按1×106密度种植于含b-FGF 20 ng/ml 和10% FBS的特制培养液进行培养，3 d后半量换液。换液前用0.01 mol/L的PBS轻轻冲洗培养细胞的表面，以去除未贴壁细胞。以后每隔3 d换液1次，去除大部分杂质细胞。约20~22 d可见岛屿状细胞团，随机挑选3培养孔作Nestin鉴定，剩余培养孔细胞团用0.01 mol/L PBS洗2遍，吸管轻柔吹打，制成单细胞悬液。特制培养基和10% FBS重悬细胞，按1×105/ml随机分为7组接种于2板12孔培养板中。每组重复3孔继续培养18~24 h后，当细胞大概30%~50%融合时进行转染。     1.3  siRNA(small interfere RNA)的制备     从GenBank上搜寻大鼠Hes5的cDNA序列，根据以下原则在编码区挑选合适的靶碱基对：(1)最适宜长度为21~23个碱基对，GC比例尽可能的接近50%；(2)避免连续3个或3个以上的鸟嘌呤；(3)最好选择由2个腺嘌呤开始的序列；(4)标记正义链3'端；(5)确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性。以下为Hes5的dsRNA序列，正义链：5'-GAGCCUG-CACCAGGACUAC-3'，反义链：5'-GUAGUCCUGUG CAGGCU C-3'，确信无误后将目的序列提交德国pro-ligo公司制作。成品为正义链和反义链混合在一起的粉剂，用时将其溶解为终浓度20 μmol/L的溶液。     1.4  细胞转染     上述细胞继续培养达到30%~50%融合时进行转染。分别取1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 μl的dsRNA原液加入到Opti-MEM溶液中使其终溶液为90 μl，而终浓度分别为50、100、150、200、250、300 nmol/L(A液)。取2 μl OligofectamineTM 转染液加入到8 μl Opti-MEM 溶液中使其总溶液为10 μl(B液)。将A、B溶液室温静置5~10 min，然后将A、B溶液轻柔混匀，室温孵育15~20 min。Opti-MEM 溶液洗细胞1次，12孔培养板每孔加400 μl Opti-MEM 溶液。将100 μl A、B混合液再轻柔混匀，加入12孔培养板，每3孔为一个浓度组。37 ℃、5% CO2孵箱孵育4 h后，加入3倍于正常浓度血清，各浓度组分别于转染后48 h提取蛋白检测。     1.5  细胞免疫化学     取培养10~12 d的鼠骨髓基质干细胞(以可见细胞团为准)， 采用SABC法进行免疫细胞化学检测。一抗为Nestin(鼠多抗，1∶200)，反应120 min(37 ℃)；二抗为生物素化羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min；三抗为链亲和酶素-生物素-过氧化酶复合物，室温孵育10 min。DAB染液显色5~15 min，着棕色细胞为染色阳性细胞。同样的实验重复3次，光镜下观察拍照。     1.6  Western blotting检测Hes5表达     收集幼鼠(14.5天龄SD大鼠)脑组织提取物、培养25 d待转染细胞及不同浓度dsRNA转染4 h细胞，用0.01 mol/L PBS清洗3遍后，按常规方法提取蛋白，15% SDS-PAGE分离蛋白质。分离后的蛋白按常规方法转膜、封闭，加入鼠抗Hes5一抗，4 ℃孵育12 h，TTBS洗膜后加入HRP标记的羊抗大鼠抗体检测Hes5的表达，阳性条带以化学发光法显示在X胶片上。实验重复3次。     1.7  锥虫蓝法检测培养细胞活力     用0.5%锥虫蓝按常规方法进行，每培养孔计数5次，每浓度组重复3次。Star统计软件对以上实验结果作统计分析。      2  结果     2.1  骨髓基质细胞的体外培养及形成神经干细胞     刚接种的细胞种类较多，大部分细胞呈圆形，包括造血干细胞及分化程度不同的其他各系细胞、MSCs等。细胞接种后24 h内见少数细胞开始贴壁生长，而大部分仍浮在溶液中的细胞呈圆形和椭圆形，细胞分裂，增殖旺盛，可见伸出小芽的细胞。48~72 h后骨髓基质细胞大部分贴壁，5 d后半量换液去除部分悬浮细胞，可见细胞增殖减慢。10 d后培养孔细胞分为2层，下层为梭形细胞铺满瓶底，上层为各种形态的半悬浮细胞，体外培养20~22 d左右可见梭形细胞层上由大圆细胞形成的岛屿状细胞团(图1)。进行免疫细胞化学鉴定该细胞团表达Nestin(图2)，免疫印迹检测表明该细胞团蛋白提取物与胚鼠脑组织提取物在Mr 25 000处有Hes5的表达，但是与胚鼠脑组织提取物相比，骨髓源性的神经干细胞Hes5的表达量稍弱一些(图3)。     图1 骨髓基质细胞体外培养20~22 d后形成的岛屿状细胞团(原放大倍数：×400)     Fig.1 Rat bone marrow stromal cells (BMSCs) forming island-like cell mass at 20 to 22 days of in vitro culture (Original magnification: ×400)     图2 岛屿状细胞团为Nestin阳性细胞(原放大倍数：×400)     Fig.2 Island-like cell mass expressing nestin, a specific antigen of neuronal stem cells (Original magnification: ×400)     图3  Western blot 检测细胞团有较强的Hes5蛋白表达     Fig.3 Western blot analysis showing strong Hes5 expression     Lane1: Protein marker; Lane2: Substance distilled from the brain tissue of 14-day-old rats; Lane 3: BMSC protein extract     2.2  适宜浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达。     免疫印迹结果提示50、100、150 nmol/L浓度的dsRNA转染细胞后仍可见Hes5(Mr 25 000)的表达，50及100 nmol/L浓度组Hes5蛋白的表达相似，而150 nmol/L浓度稍弱。表明50及100 nmol/L浓度的dsRNA不能阻断内源性的Hes5的表达，而150 nmol/L浓度可部分抑制Hes5的表达；200、250、300 nmol/L转染组则无Hes5蛋白的表达(图4)。说明200 nmol/L 及以上浓度的dsRNA能在神经干细胞内启动RNAi作用，从而特异有效阻断Hes5的表达。     图4不同浓度dsRNA特异性阻断Hes5表达情况     Fig.4  Inhibition of Hes5 expression with dsRNA of different concentrations     Lane1: Protein marker; Lane 2: 50 nmol/L; Lane 3: 100 nmol/L; Lane 4: 150 nmol/L; Lane 5: 200 nmol/L; Lane 6: 250 nmol/L; Lane 7: 300 nmol/L     2.3  低浓度的dsRNA有利于干细胞细胞存活     转染对照组及50~200 nmol/L浓度转染组细胞均能正常生长，但形态存在明显差异。50~100 nmol/L转染组形态无显著变化，转染48 h后仍以大圆细胞为主，细胞活力好。150 nmol/L组可见部分细胞分化，200 nmol/L转染组细胞则大部分分化，可见部分细胞老化及死亡。而250 nmol/L高浓度转染组有少部分细胞分化，大部分细胞胞膜不完整，细胞内有黑色颗粒及空泡。300 nmol/L组细胞于转染后24 h大部分凋亡。0.5%锥虫蓝法检测培养细胞活力及统计结果表明，各浓度组之间存在显著差异，浓度与细胞活力呈负相关，相关系数为-0.9。这些结果提示，虽然高浓度dsRNA能更有效地阻断内源性Hes5蛋白的表达，但是高浓度对细胞毒性也不可低估，低浓度的dsR-NA则更有利于细胞存活(图5)。     图5 不同浓度的dsRNA转染BMSCs 48 h后细胞存活率     Fig.5 Survival rate of the BMSCs 48 h after transfection with dsRNA of different concentrations      3  讨论     Notch信号转导通路是发育期间一条重要的通路，研究表明它在大量的组织和器官包括神经组织的发育中发挥重要作用，调控着组织类型及形态的发生[1] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150002#LAB2004000150002" [2] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150003#LAB2004000150003" [3] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150004#LAB2004000150004" [4] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150005#LAB2004000150005" [5]。转录因子Hes5特异性表达在神经干细胞中，是Notch信号在细胞内重要的下游靶转录因子。它是否表达在骨髓源性神经干细胞发育过程中，究竟有什么作用？     Timmons等[6]在1998年首次提出“dsRNA介导的RNAi”具有高效性和特异性，随后的研究发现，在各种生物，如果蝇、拟南芥菜、及小鼠等[7] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150008#LAB2004000150008" [8]均存在dsRNA介导的RNAi现象，表明RNAi可能是生物普遍存在的转录后水平上调节基因表达的方式。进一步研究发现体外合成长链dsRNA在植物和低等生物中能发挥特异的RNAi作用，但应用于哺乳动物细胞中却出现明显的非特异性反应[9] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150010#LAB2004000150010" [10]，包括引起细胞的非特异性基因降解，甚至整个细胞蛋白质合成停止而导致细胞死亡。2001年5月，Elbashir 等[10]首先报道了以体外合成的siRNA转染哺乳动物细胞造成特异性基因抑制的结果，293细胞链和Hela细胞链被转染特异性dsRNA后，靶mRNA所表达的蛋白质的量比转染前降低了90%，但却并未发现非特异性基因抑制及细胞死亡。而后的多项研究进一步证实，体外合成的dsRNA不论在低等生物如线虫，还是在高等生物如人、鼠的细胞中，均能发挥其强大、特异的基因抑制功能[11] HYPERLINK "http://www.jfmmu.com/cgi-bin/SEARCH.EXE?COMM_RECNO=1532&COMM_RLTID=9" \l "LAB2004000150012#LAB2004000150012" [12]，这一点对于体外转导的基因和细胞的内生基因同样有效。并且，体外合成dsRNA触发RNAi所需的有效浓度很低。     尽管这样，Timmons却发现RNAi似乎对神经干细胞无作用[13]，而Paul等[14]则认为高浓度(15 μg/ml)的dsRNA在线虫神经元培养过程中，无论是增殖或者分化期都能有效的降解目的基因。说明dsRNA对于神经细胞来说是一种很弱的基因沉默工具，且高浓度的dsRNA引入大多哺乳动物中，会引发强烈的细胞毒性，即引起PKR反应导致mRNA大范围的转录停止。最近几个研究团体设计了一个替代方法，即通过转染质粒DNA使神经元内源性的表达dsRNA，但是收效甚微。考虑主要是由于分裂后的原代培养神经元转染效率低，且转染本身对神经元就是一个细胞毒性作用所致。目前还未见关于dsRNA阻断神经干细胞的报道。本实验表明，与电转细胞死亡率50%~75%相比，终浓度为200 nmol/L的dsRNA转染细胞，其死亡率要低一些(约30%~40%)，同时又能有效阻断骨髓源性神经干细胞的Hes5基因表达。免疫印迹证实低于此浓度，还可见强烈的Hes5的表达，而高浓度的dsRNA虽然能阻断神经干细胞的Hes5基因的表达，但却导致大部分神经干细胞的凋亡，对后续实验不利。锥虫蓝法检测可见满视野的死细胞，也证实了这一点。说明体外合成的短dsRNA能在神经干细胞内引发特异性的基因降解，但必须浓度适宜。     除了dsRNA的浓度外，一些外在的因素如转染时细胞的浓度、贴壁情况等都对转染成功与否有一定程度的影响。另外，细胞转染后可能还有特定细胞因子参与了dsRNA的转运和RNAi的调控，实验中亦发现BDNF似乎有利于提高转染率或者干细胞的存活(数据未提供)。     在目前RNAi技术作为遗传学工具已经越来越受重视，随着技术难题的解决，它在基因-蛋白质的功能研究中的作用将更显著。但是RNAi在干细胞分化调控中的研究还存在许多问题，比如它在神经干细胞的确切机制还不为人知，是否通过干扰RNA的稳定性、迁移或者转录来实现，RNAi是否与其他的信号通路有交叉作用，RNAi是否与转录水平相偶合，如何才能在更有效地将dsRNA导入神经干细胞或神经元细胞的同时又能最大程度地提高细胞的存活率等，都需作进一步探讨。 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入 本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！