TSH荧光酶免疫分析法1

nullTSH荧光酶免疫检测法TSH荧光酶免疫检测法相关帮助相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入一、先天性甲低的新生儿筛查方法一、先天性甲低的新生儿筛查方法1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoassay，EIA) 2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) 3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA) 一、先天性甲低的新生儿筛查方法一、先天性甲低的新生儿筛查方法4、时间分辨荧光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoas—say 5、荧光酶免疫分析法FEIA fluoreseenceenzymeimmunoassay 6、自动新生儿疾病筛查系统(automatednewbornscreeningsystem)TSH荧光酶免疫分析法TSH荧光酶免疫分析法FEIAFluorescence enzyme immunoassaynull1、原 理1．原理1．原理荧光酶免疫分析法(FEIA)是一种高度灵敏的检测方法，用FEIA测定血hTSH基于一步夹心法原理，采用固相、双位点荧光酶免疫分析法。 干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体结合。null被测TSH抗原被测TSH抗原有两个抗原决定簇 故叫双位点β位点α位点nullTSH单克隆抗体TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体包被在反应板上的 TSH单克隆抗体 故叫固相nullHPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HRP 辣根过氧化物酶(HRP)标记的 抗hTSH—亚基（ β位点）的第二抗体nullTSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HRP被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRPHRP打入血斑（TSH）并加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体溶液于已包被TSH单克隆抗体的酶标反应孔内。（一步法）PH：6.5nullTSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HRP被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRPHRPHPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HRPHRP 干血斑中洗涤出的hTSH，同时与包被在酶标板上抗hTSH的单克隆抗体分子和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗hTSH—亚基的第二抗体结合。nullTSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HRPHRPHRP 过量的酶结合物和未结合的hTSH被洗涤去掉。 只剩下TSH同时与包被在酶标板上抗TSH的单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TSH—亚基的第二抗体结合物。 被检测TSH抗原被夹在中间，故又称夹心法。nullTSH单克隆抗体被测TSH抗原TSH单克隆抗体TSH单克隆抗体被测TSH抗原被测TSH抗原HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HPR标记的抗TSH 亚基单克隆抗体HRPHRPHRP加入荧光底物3-P-羟基苯丙酸(HPPA)和双氧水进行酶反应。HPPAH2O2HPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAHPPAH2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2H2O2PH：7.8 2HPPA+H2O2 DPDPA+2H2O 无荧光 3-P-羟基苯丙酸HRPH2O22HPPADPDPA2H2O荧光物质作用1小时原理原理以甘氨酸缓冲液终止酶反应。DPDPA甘氨酸缓冲液DPDPAPH：10.3原理原理用荧光读数仪以320nm为激发光，405nm为发射光测定荧光值。由于荧光强度与酶标反应板上结合的hTSH数量成正比，因此，通过已知浓度的血斑荧光值和样本的荧光值，也就可换算出样本血斑中hTSH的含量。用TSH荧光酶免 疫分析法FEIA检 测hTSH的灵敏度 达0.037mIU／L特点：特点：①荧光物质为DPDPA，是由HPPA与双氧水在HRP的作用下脱氢结合而成，它吸收特定波长（320nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长（405nm）的光。DPDPA 激发光 波长320nm发射光 波长405nm特点：特点：②鉴于HPPA（3-P-羟基苯丙酸）敏感性高、动力学范围广，已被广泛用于替代传统EIA显色剂，作为辣根过氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可检测极低和极高浓度，具有明显优势，由于hTSH样本正常值与非正常值之间差异大，故该法特别适用于hTSH检测。特点：特点：③HPPA／H2O2反应生成的荧光强度的影响因素中，最重要的是底物浓度、反应液和终止液的pH值。酶反应最佳pH值为7.8。加入碱性缓冲液终止酶反应，又可显著增强荧光强度。经测定，使用pH10.3、1.5 mol／L甘氨酸缓冲液可获得最大荧光强度。在低浓度hTSH下，该缓冲液可使荧光强度增加5倍，当hTSH浓度高于80mIU／L时，增强作用依次减弱。特点：特点：④荧光产物稳定，可放置过夜后测定。无论在室温(20～25℃)或30℃孵育用FEIA测定hTSH的敏感性无变化；而在37℃条件下孵育会增加背景荧光，降低灵敏度。建议底物孵育温度为20～30℃。特点特点⑤FEIA检测法方法先进，重复性高。 一般情况下，批内分析变异系数和批间分析变异系数均小于10％。特点特点⑥应用FEIA法进行hTSH检测时，其他垂体激素和人绒毛膜促性腺激素(HCG)对实验的干扰极小。null2、仪器和试剂以下仪器均由 芬兰Labsystems公司提供以下仪器均由 芬兰Labsystems公司提供荧 光 读数仪孵 育 振荡仪自 动 洗板仪3 m m 打孔器单 道加样器八 道 加样器电 脑 显示屏(1)、仪器：(1)、仪器：①、荧光读数仪； ②、孵育／振荡仪； ③、自动洗板仪； ④、3mm打孔器，或打孔钳； ⑤、加样器；八道加样器。 以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。 ⑥、3mm实验血片塑料支架； ⑦、电脑、打印机； ⑧、冰箱。材料材料①、新生儿筛查滤纸干血斑标本：用S&S903滤纸，按新生儿疾病筛查滤纸干血斑标本采集方法采集； 试剂试剂芬兰LabsystemshTSH-FEIA试剂盒，包含如下物品抗hTSH包被的酶标板（1）抗hTSH—HRP酶结合物（2）酶结合物稀释液（3）HPPA荧光底物（4a）H2O2溶液（4b）终止液（5）洗涤液（6）试剂试剂①、抗hTSH包被的酶标板（1）：抗hTSH抗体IgG(小鼠单克隆抗体)包被的酶标板，浓度>1.0μg/m1。所有包被酶标板均置于有干燥剂的锡箔密封袋中以防止潮湿。潮湿将破坏酶标板的包被，严重缩短试剂盒保存期。试剂盒通常储存在2—8℃，为防止打开锡箔密封袋时水蒸气凝结破坏酶标板性能，试剂盒使用前需置室温半小时后再打开。若锡箔密封袋在使用前受损或干燥剂变色，请勿使用；null②、抗hTSH—HRP酶结合物（2） ：辣根过氧化物酶标记的抗hTSH(小鼠单克隆抗体浓度>50ngIgG／m1)抗体，加0．2％的KathonCGe作为防腐剂；试剂试剂试剂③、酶结合物稀释液（3） ：缓冲盐溶液，pH6.5，加0.2％的KathonCG~作为防腐剂。用于酶结合物的稀释；null④、HPPA荧光底物（4a） ：3—P—羟基苯丙酸溶于Tris缓冲液(pH7.8)中，加0.2％的KathonCGe作为防腐剂；试剂null⑤、H2O2溶液（4b） ：柠檬酸—醋酸缓冲液，pH6.0，含过氧化氢。避免与氧化／还原剂接触；试剂null⑥、终止液： 甘氨酸缓冲液（5） ，pH10.3；试剂null⑦、洗涤液（6） ：含有吐温20的磷酸盐缓冲液，加入0.05％Broni—dox作为防腐剂。按1:9比例加入蒸馏水稀释。由于储于4℃可能形成结晶，稀释前温度需达18—30℃；试剂null⑧、hTSH标准品（7） ：TSH存在于干血滤纸片的血斑中，包括一个零空白。存于装有干燥剂的铝箔袋中。加入0.05％Bronidox作为防腐剂。标准品由红细胞压积为50％一55％的人血液制得，所含的hTSH浓度经过WHO2nd IRP(80／558)校正；试剂null⑨、质控物（8） ：hTSH存在于滤纸上的干血滤纸血斑中。加入0．05％Bronidox作为防腐剂。1张滤纸中具有5套2种浓度质控物(品)，存于装有干燥剂的铝箔袋中。 标准品和质控物(品)的TSH浓度有批号差异，需参照每一试剂盒中的标准品和质控物(品)的记录单。试剂全血样品中TSH含量与血清样品中TSH含量的转化公式 TSHmIU／L血清＝TSHmIU／L全血×lOO／(100—HCR)试剂盒内的TSH标准品和质控物的浓度试剂盒内的TSH标准品和质控物的浓度3、实验操作3、实验操作实验操作步骤实验操作步骤(1)用编码机给每一张血片按次序盖上卡片号，此卡片号也就是我们的检验编号。 在检验前，所有的试剂和酶标反应板应放置室温平衡30分钟。实验操作步骤实验操作步骤(2)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。 编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号在电脑中用不同的颜色的字打印出来，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。 佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: TSH 检测时间: 2003年11月11日 操作者：佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: TSH 检测时间: 2003年11月11日 操作者：试剂批号：163ZC1 标准浓度：1、9、20、44、66、87。 质控批号：163ZC1 范 围：①高值：14-37，中值26。②低值：0-5，中值3.0。实验操作步骤实验操作步骤（3）对照操作卡在滤纸血斑上打下直径3mm的标准品(双孔)、质控物(品)(双孔)和标本，并依次放置到抗hTSH包被的酶标板孔内。注意：为避免层析效应，应围绕血样点中央对称地打孔。血斑打孔的位置血斑打孔的位置打孔时要选择合格的血斑，同时要选择合适的地方，两面都要看一下。由于层析效应中心位比周边位的 浓度要高10%左右。正确太靠边太中心实验操作步骤实验操作步骤(4)加入200μl抗hTSH—HRP酶结合物。然后用胶膜覆盖密封。 配制抗hTSH—HRP酶结合物溶液：一个酶标反应板需配量，200μl酶结合物（2号溶液）加20ml酶结合物稀释液（3号溶液）。实验操作步骤实验操作步骤(5)选择以下步骤进行孵育： 过程A：室温(18—30℃)振荡孵育3小时，振荡速率650转／分。 过程B：室温(18—30℃)振荡15分钟，4℃过夜孵育。 备注：室温超过30℃，最好选择过程B孵育，以避免高本底干扰。实验操作步骤实验操作步骤(6)洗板 ①手工洗涤：去掉溶液和滤纸片， 每孔加入300μl的洗涤液，倒去孔内液体并拍打，使孔内无残液，重复操作4次，倒置于纸巾上； ②洗板仪洗涤：洗涤液每孔400μl，先洗涤一次，甩掉溶液和滤纸片，再重复洗涤4次。 使用电动打孔／去纸片系统可简化实验操作。如Labsystems公司的电动打孔器可将样品固定在一次性塑料支架上，将带有样品纸片的支架插入酶标板反应孔内进行反应。孵育结束后，样品纸片和支架一同去除。实验操作步骤实验操作步骤(7)每孔加入200μl底物溶液。底物溶液的配制：每个3酶标反应板配60ml，即50mlHPPA溶液（4a溶液）加10ml双氧水溶液（4b溶液）。 (8)室温18—30℃振荡孵育l小时。 (9)每孔加入100μl终止液，即甘氨酸缓冲液（5号溶液） 。 (10)在60分钟内，用荧光读数仪测定各孔的荧光值。实验操作步骤实验操作步骤打孔洗板加酶标液加底物液加终止液检测null4、结果计算结果计算结果计算测量结束后，可利用电脑工作软进行自动处理绘制标准曲线，推荐使用线性坐标，选择光滑曲线。也可使用手工计算。从标准曲线上读取质控物和标本的TSH浓度。 在试剂盒中均应有质控物(品)和其期望值，只有当质控物(品)测定值在其范围内，该次实验才能视为合格。结果计算结果计算发出实验报告。 做好结果的登记。 保存好结果的原始资料。null5．注意事项注意事项注意事项(1)所用试剂需正确储存，不恰当的保存方式可能造成荧光背景增加，标准曲线斜率降低，进而影响实验精确度。试剂一般储存在2—8℃。 (2)勿使用过期试剂。 (3)不同批次试剂不可混合或互换。 (4)开始检测前，把试剂盒内所用的试剂和酶标板放置室温平衡30分钟。 (5)建议每块酶标板都使用标准品和质控物(品)，并作双孔。 (6)勿互换试剂瓶盖。注意事项注意事项(7)从试剂瓶中转移液体时，使用无菌的移液管以避免污染，否则由于试剂污染可能产生不正确的结果。 (8)检测一旦开始，随后的步骤应连续地进行下去，不要中断。 (9)加样时勿接触孔壁，以避免孔间交叉污染。(10)孵育时间的轻微变化是允许的，首次孵育和二次孵育许可时间分别为：3小时土10分钟和1小时土5分钟。 (11)使用过夜孵育过程，实验结果可获得较高的重复性。 (12)空气的洁净度可能影响实验结果。null 谢谢！