疣荔枝螺微粒体细胞色素P450酶系的光谱分析

第26卷，第1期 2 006年1月 光谱学与光谱S畦Iectr(唧yarldS运)ectralAmlysiS v01．26，No．1，ppl30一133JaIluary，2006 疣荔枝螺微粒体细胞色素P450酶系的光谱分析 韩雅莉1，邓瑞鹏2，周小朋2 1．广东工业大学轻工化工学院，广东广州510090 2．汕头大学生物系，广东汕头515063 摘要从疣荔枝螺内脏团制备得到微粒体，用uvmini一1240分光光度计对细胞色素P450酶系的三种主 要成分：细胞色素P450、细胞色素b5，NADI，H-细胞色素P450还原酶进行了测定，并对微粒体酶液进行 sD|S—PAGE电泳测试，证明了疣荔枝螺体内含有细胞色素P450酶系的三种酶。 主词疣荔枝螺；微粒体；细胞色素P450酶系 中图分类号：Q559．9文献标识码：A 文章编号：1000—0593(2006)01—0130—04 引 言 有机锡(c嚼notin)是至少含有一个Sn—c共价键的金 属有机化合物，由于其对水生生物有显著的杀生作用，近20 年来作为新型防污涂料被广泛用于船坞保护业，由此对海洋 环境造成了严重污染，这类物质已成为人为引入海洋环境中 毒性最大的物质之一，现已发现多种底栖软体动物由此而产 生了不同程度的畸变现象[1圳。国外学者推测有机锡对生物 体最重要的代谢酶系(Ec1．14．14．1)——细胞微粒体混合功 能氧化酶系产生了抑制作用，该酶系主要包括细胞色素 P450，N√如PH细胞色素还原酶和细胞色素b5还原酶，其典 型反应为RH+Q+NADPH+H+—一ROH+H20+ NADP+，即通过电子传递系统将分子氧化还原，并将其中一 个氧原子加到底物中，反应需要NADI)HHl。 疣荔枝螺(nlaiscl删gera)属软体动物门，其味鲜美是我 国沿海居民广为食用的贝类之一，喜栖于沿海浅滩及港湾水 域中，而这里恰为有机锡污染严重之处，大量研究发现疣荔 枝螺的性畸变程度与有机锡污染成正相关性【6’7I，因此将该 螺作为监测有机锡污染的指示物种。本文分别从疣荔枝螺内 脏团分离得到微粒体，对P450酶系的3个主要组分b1细胞 色素P450，细胞色素b和NADI)H．细胞色素P450还原酶进 行光谱分析，并通过SEIs聚丙烯酰胺凝胶电泳检测螺体内该 酶系的存在情况，为了解软体动物P450的存在情况和进一 步探讨P450酶系在该类动物体中所起的作用提供参考依据。 1实验 1．1仪器和试剂 BeckmallJ2—21M高速冷冻离心机；0ptbaLE一80K超速 收稿日期：2004-06—16，修订日期：2004—09—28 基金项目：国家自然科学基金(30271033)资助项目 作者简介：韩雅莉，1957年生，广东工业大学轻工化工学院教授 离心机(Beckman)；shimadZIlUVvisibleSpectmph0衄neter uVIIlim一1240紫外．可见光分光光度计(日本岛津公司)； 趴憎一Ⅲ稳压稳流电泳仪和DY■Ⅲ28垂直夹芯电泳槽(北京 六一仪器厂)等。标志蛋白(上海生化研究所)，苯硫尿刖 (北京试剂厂)，连二亚硫酸钠(分析纯，上海化学试剂厂)， 1，4一二硫代苏糖醇聊盯(BBl分装)，苯甲基磺酰氟PMSF (BBl分装)，考马斯亮兰R一250(FIuI【a进口分装)，辅酶Ⅱ (NAⅨ)H)(上海生化研究所)，牛血清白蛋白琰涟(Fluka进 口分装)，细胞色素C(北京试剂厂)。 1．2实验 1．2．1微粒体的制备 疣荔枝螺(Thaisclavigera)分别采自汕头市北山湾和南澳 岛海区。平均体重6．5g，活体运回实验室，暂养于水箱。每 次制备酶液用成年雌、雄螺各25只。 分别取新鲜雌、雄螺内脏团7～10．5g(每个内脏团平均 重350Ing)，剪成小块置小烧杯内，按1：2(|0)加入匀浆液 (O．1md·L_1磷酸钠缓冲液pH7．5，含l眦0卜L11咣， 0．1Hmlol·L一1DTT，1nmol·L1PTU，1nmol·L一1PMSF和 10％甘油)旧J，用内切式组织匀浆机制成匀浆，匀浆液在10 妇离心20nlin，上清液经4层纱布过滤，再经100k超速离 心1h，弃上清液，得微粒体沉淀，将其悬浮于上述匀浆液置 一80℃冰箱储存备用。以上操作均在4℃下完成。 1．2．2细胞色素P450含量测定 参照文献[9]的方法并加以改进。将稀释至1mg·mL。1 的微粒体悬浮液倒入10H1L小试管中，加入5nlg连二亚硫 酸钠，混匀后等分到参比杯和样品杯中。参比杯作空白，在 紫外分光光度仅(uvmini．1240)扫描基线，然后在样品杯中 通入C01rIlin，在波长400～500衄范围扫描，得到还原型 万方数据 第1期 光谱学与光谱分析 131 细胞色素P450一C0复合物吸收光谱图，记录C0差光谱，以 △0D。：。一。卯=9l为毫摩尔消光系数及酶液的蛋白浓度计算细 胞色素P450的含量。 1．2．3细胞色素k含量测定 参照文献[9，10]的方法并加以改进。将稀释至1n培· mL。1的微粒体悬浮液倒入10mL小试管中，然后等分到参 比杯和样品杯中，先将参比杯在紫外一分光光度仪上扫描基 线，然后在样品杯中加入5H堰连二亚硫酸钠，混匀，在波长 400～500m范围扫描，记录吸收值。以△0lD4：。枷=185为 毫摩尔消光系数及酶液的蛋白浓度计算b5含量。 1．2．4细胞色素P450还原酶活性测定 参考文献[11]的方法并加以改进。取1．5mL0．1nlol· L。1pH7．8的磷酸钠缓冲液，加入50止，5mg·n1L。1细胞色 素C，0．5mL微粒体粗酶液和50止1．5mg·rIlLlNADPH， 连续3min用紫外一分光光度仪测定在550眦光吸收(0珐卯) 值，以毫摩尔消光系数21．1及酶液的蛋白浓度计算细胞色 素C被还原的量。 1．2．5S【)S—PAGE电泳测定蛋白质含量 采用垂直板电泳，4％浓缩胶，12％的分离胶，恒流20 rnA，上样量为100旭总蛋白，采用考马斯亮蓝染色法，以牛 血清白蛋白为分子量参照物。 2结果与讨论 2．1 疣荔枝螺微粒体蛋白sD岛PAGE电泳鉴定 细胞色素P450酶系是存在于微粒体中分子量40～60 kDa范围内的一类蛋白质[1引。本试验对疣荔枝螺内脏团匀浆 后高速离心得到微粒体，经sDs聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马 斯亮蓝染色，显出分子量在40～60龇范围内的条带3条 (见图1，箭头所示)。目前从不同生物获得的该酶同工酶组 分有所差异，如从大白鼠肝微粒体中至少鉴定出6种组分， 从抗性品系家蝇微粒体中分离出4种组分，组分的差异可能 与物种进化程度有一定关系。 F蟾．1 SD$PAGEpatter晒ofT．c缸订g盯淞 MStandardprotein(Marker)； 1，f锄1ale；2，male 2．2疣荔枝螺P450酶系3种主要组分测定 分别在波长400～500和550m下对雌、雄疣荔枝螺 P450酶系3种主要组分进行扫描，由表1可以看出雌、雄疣 荔枝螺内脏团微粒体细胞色素P450和细胞色素b5还原酶含 量以及NADI)H细胞色素还原酶活性存在一定差异，其中两 性样品的细胞色素b5还原酶差异不显著，而细胞色素P450 雌螺的含量约为雄性的2倍，雄性NADPH细胞色素还原酶 活性约为雌性的1．7倍。细胞色素P450酶系是动物体内类 固醇激素生物合成过程中的限速酶，类固醇激素的合成转化 途径为胆固醇先转化为雄烯二酮，后者再转化为睾酮和雌 酮，其中细胞色素P450可以催化雄烯二酮转化为睾酮和雌 酮(或17p雌二醇)，因而细胞色素P450酶系中各组分和活 性的差异，在一定程度上表明了雌雄性别之间的差异，即在 转化类固醇激素为雄激素或雌激素方面有所差异。 ’I抽k111le㈣p叫朗ts0fP450咖off咖le锄dnlaleT．出咖s DataareMeall±StaIlda—deviationoft}lreeorfourr印licates 2．3细胞色素P450紫外．可见吸收光谱 本试验中将疣荔枝螺内脏团微粒体酶液用二亚硫酸钠还 原后通C0，在400～550m范围扫描，分别在420和450 啪处各得到一C0差光谱特异吸收峰(见图2)，表明酶液中 除P450外还有细胞色素P420存在，而且P420含量远远大 于P450，两者之比约达5：1。P450酶系为多酶复合体，．它们 由一组以Fe卟啉为活性位置的血红素单链蛋白质组成，能 够使氧通过催化作用加合于底物，其还原态与C0结合后生 成的配合物(见图3中d)在波长450m处有特异吸收峰，其 在生物体内所参与的循环如图3。在生物多功能氧化酶反应 中P450起末端氧化酶的作用，它不仅负责与氧分子结合活 化氧，而且有底物结合位点，故决定酶的专一性；还原型 P450可与OO竞争性结合而成为六配体，活性降低，其最大 吸收由420眦转入450呦。P420是细胞色素P450的前体 形式。由于在微粒体膜上有磷脂组分，内含有未饱和脂肪 酸，空气能将其氧化为脂过氧化物，在此过氧化物作用中 P450易被分解为P420，在增溶处理时也诱导其变为P420， 此外在制备和测定过程中02、高温或增溶剂等都会使P450 酶转化为P420，因而P420就是失活状态的P450。事实上， 作者考虑到上述因素对P450酶系的不利影响，在本实验的 缓冲溶液中加入几种试剂来防止P450的变化，如PMsF为 蛋白酶抑制剂，瑚盯和刖为二硫键保护剂，EcrrA能螯 万方数据 132 光谱学与光谱分析 第26卷 合干扰离子，甘油能保护P450，试验结果表明试验中部分 P450已经处于失活状态，其中大部分P450已转化为P420， 表明所加入的保护剂未能起到预期的作用。 Wavelen甜h，nm Fig．2Diffe咖cespect舢ofT．出咖slIli∞啪眦 咖hromeP450reducedby∞rb∞ 2．4细胞色素b5的紫外．可见吸收光谱 细胞色素b5是亲水脂蛋白，由两种蛋白组成，一为与生 物膜相互作用的疏水性蛋白，另一为含氧化还原活性的血红 素分子的亲水性蛋白，这两种蛋白以15个氨基酸残基相 连b]。氧化型的血红素蛋白最大波长为413啪，还原型细胞 色素的波长为423，526和557mu2|。图4可以看出本试验 疣荔枝螺微粒体细胞色素bs在426啪左右有一最大吸收 锋。在一定的实验条件下，加入适量连二亚硫酸钠可以诱导 细胞色素b的血红素中心核还原，但对卟啉基团影响不大， 仍处在氧化态，这种变化在差光谱上表现为426m左右的 正峰和409唧左右的负峰。 F追．3枷i伽cyde0fcytochmmeP450籼 WaⅣelengm／nm F幢．4Di髓e瑚tspec”哪ofT．幽喱g田铘micms珊豫 c)伽dl舢b 参 考 文 献 [1]zH0uMingjiang，LIzh∞g—yan，YANTiall(周名江，李正炎，颜天)．AdvancesinEn、，i㈨mtalsci踯ce(蚪忆科学进展)，1994，2(4)： 67． [2]sHIHua．bng，HuANGchang．jiang，xIEwen_yang(施华宏，黄长江，谢文勇)．Ma曲eEnvi姒蜘∞t81sciem、／海洋环境科学)，2002，2l (4)：37． [3] [4] [5] [6] [7] [8] 9 10 11 12 SHIHua，hong，HUANGChallg．jiang(施华宏，黄长江)．ActaE∞lo西casinica(生态学报)，2001，21(10)：1711． HANYa_1i，珊0uxiao_peng，LIxiIlg—nuan(韩雅莉，周小朋，李兴暖)．J01蛐alofShnghaiFish耐eSu11iversity(上海水产大学学报)， 2003，12(2)：174． u：NGxin-fu，QIuXing-hui(冷欣夫，邱星辉)．Structure，FunctionandPe珥)ect0fC”ochromeP450(细胞色素P450酶系的结构、功能与 应用前景)．Be4iIlg：SciencePreSs(北京：科学出版社)，2001．1． SpoonerN，GibbsPE，BryanGW．Mar．Environ．Res．，1991，32：37． BettinC，oehjmannJ，strobmE，eta1．HelgolMeeresunters，1996，50：299． s娅NJun，xuPei—pei，JINxi—p∞g(沈钧，徐佩佩，金锡鹏)．Industrial}IygieneaIld0ccupathlalDiseaSe(工业卫生与职业病)，1997， 23(4)：236． Tsune0omura，RyoSat0．JouHlalofBiologicalcherr正stry，1964，239(7)：2370． QIUxing_hui，L1wei，LENGXin-fu(邱星辉，李薇，冷欣夫)．Actaz耐。西caSinica(动物学报)，2002，48(2)：208． JorgeC，AntonioM，～bertSP．MoisesA罾0sin．BiocheIrdstry，1973，12(7)：1445． LIR叭．qiang，C眦NYao，JIANGF肌g—yi(李任强，陈瑶，江凤仪)．spectrosoopymdspectralAnalysis(光谱学与光谱分析)，2004，24 (1)：58 ∞u量口．Io∞o．《 万方数据 第1期 光谱学与光谱分析 133 SpectralAnalysisandStudyoftheMicrosomeCytochromeP450 AromataseofT况nZscZ口'，ZgPrn HANYa—lil，DENGRui—pe时，姗uxi舱pe《 1．FacultyofCh础calEn西ne耐ngandLightIndustry，GuangdongumverSityOf亿hnology，GuaJlgzhou510090，(hm 2．DepartmentofBiology，ShantouU“verSity，Shallt叫515063，CKm Abs蛔ctThemicrosomeswereprepa托dfrornthevisceramassesOfT阮厶如谢g踟5．Itiswellkl嘶mthattherearesomemaino咖一 ponentSin“crosomecy髋hⅫneP450删tase，includingcytochrorneP450，c眦h贼neb5andNADPH_cytOch)meP450 reductase．S0the00ntelltsofcytoch砌neP450andcytochromeb5，a11dtheactivityofNADPH-cytochrorT】eP450reductaseweredeter— rninedbyShinladzuUVⅥsiblespect姊hotometer．AndtherIli瞳跚a1proteillSwere咖IysedbySDSR气GE．舢lthere“tsindicat— edthattheree】【istSP450aromintheT．c肠z匾酽ms． Key啪rds讹缸幽诹黝；MicrosOme；(狮hrCmeP450删taSe (ReceivedJun．16，2004；acc印tedS印．28，2004) 第十四届全国分子光谱学学术会议(第一论通知) 会议简介 “第十四届全国分子光谱学学术会议”由中国化学学会物理化学委员会和中国光学会光谱委员会联合主办、吉林大学超分 子结构与材料教育部重点实验室承办，定于2006年7月8～11日在长春召开：届时，会议将就分子光谱基础研究和应用技术 等进行广泛的学术交流，同时将邀请国内外知名学者对有关学术领域的热点问题做报告，会议将组织各类专题讨论和学术交 流。 本次会议是我国分子光谱界的又一次聚会和高水平、高信息容量的学术交流。竭诚欢迎全国高等院校、科研机构和产业 部门从事分子光谱研究和应用开发的同事和朋友们来吉林大学参加会议，交流最新研究成果，推进分子光谱基础研究和应用 技术在国民经济和高新技术开发中的广泛应用和技术转化。我们真诚期待着国内外同行在2006年7月相聚在美丽的北方城 市——长春。 征文范围 分子光谱理论研究、激光光谱测量、红外、拉曼、振动、紫外、可见、发射、吸收、x射线荧光光谱等在冶金、地质、机械、 环保、国防、医药、农林、化工、商检及其他各领域的最新研究成果、学科发展前沿和进展。内容未在期刊杂志上发表过 或其他全国或国际会议宣读过。具体涵盖下述各方面： 1．理论研究(振动分析，分子动力学／量子化学计算和结构，光谱线型和强度) 2．超快现象、时间分辨、非线性效应 3．二维相关光谱 4．近红外光谱 5．表面等离子共振(趼)R)技术 6．表面增强光谱(红外、拉曼、荧光光谱) 7．红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱、磷光光谱、紫外一可见吸收光谱、激光光谱、光谱成像技术等在催化及表面／界面科 学、分析化学、生物科学、医学、药学、新材料、矿物、地学、工业过程、环境和其他领域的应用。 征文要求 提交论文扩展摘要一份，纸张大小用A4纸版式(用0峨cew0一软件排版，页边距为2锄，单倍行距)。扩展摘要按以下顺 序排版：文题(三号黑体居中)；作者(四号仿宋居中)；单位(小四号宋体居中，含所在省市、邮政编码、电子邮址(如有)；论文 的创新性，研究意义与结果(五号宋体)；主题词和主要参考文献(自版芯左起，五号宋体)。文稿中可穿插主要论据的图、表和 照片，图题、图注和表题、表注一律用英文表述。具体投稿要求可参看及《光谱学与光谱分析》征稿简则。届时请您登陆我 们的网站，将您要提交的论文通过网页上传给我们。也可以通过信件方式投稿。稿件一经录用，将由《光谱学与光谱分析》以 增刊形式全文发表。 (下转第136页) 万方数据 疣荔枝螺微粒体细胞色素P450酶系的光谱分析 作者： 韩雅莉， 邓瑞鹏， 周小朋， HAN Ya-li， DENG Rui-peng， ZHOU Xiao-peng 作者单位： 韩雅莉,HAN Ya-li(广东工业大学轻工化工学院,广东,广州,510090)， 邓瑞鹏,周小朋,DENG Rui-peng,ZHOU Xiao-peng(汕头大学生物系,广东,汕头,515063) 刊名： 光谱学与光谱分析 英文刊名： SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS 年，卷(期)： 2006,26(1) 被引用次数： 1次 参考文献(12条) 1.施华宏;黄长江;谢文勇 用疣荔枝螺性畸变监测海洋有机锡污染的方法初探[期刊论文]-海洋环境科学 2002(04) 2.李任强;陈瑶;江凤仪 查看详情[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2004(01) 3.JorgeC;AntonioM;Albert SP 查看详情 1973(07) 4.Tsuneo Omura;Ryo Sato 查看详情 1964(07) 5.沈钧;徐佩佩;金锡鹏 查看详情 1997(04) 6.Bettin C;Oehlmann J;Stroben E 查看详情 1996 7.Spooner N;Gibbs P E;Bryan G W 查看详情[外文期刊] 1991 8.冷欣夫;邱星辉 细胞色素 P450酶系的结构、功能与应用前景 2001 9.韩雅莉;周小朋;李兴暖 三丁基锡致软体动物性畸变机制[期刊论文]-上海水产大学学报 2003(02) 10.施华宏;黄长江 有机锡污染与海产腹足类性畸变[期刊论文]-生态学报 2001(10) 11.邱星辉;李薇;冷欣夫 棉铃虫6龄幼虫中肠与脂肪体微粒体P450酶系的比较[期刊论文]-动物学报 2002(02) 12.周名江;李正炎;颜天 查看详情 1994(04) 引证文献(1条) 1.肖敏.杨娇艳.肖文精.杨劭 结合光谱法在DMIs类杀真菌剂筛选中的应用[期刊论文]-生物工程学报 2007(6) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_gpxygpfx200601035.aspx