EB病毒与干综合征发病相关性的研究

EB病毒与干综合征发病相关性的研究 乙躺: 中华学杂志l994年2月74巷第2期 EB病毒与干燥综合征发病相关性的研究 . 贺联印王京华王申五杨铁生杜绍时樊春红S-,-二 .\ 摘要为丁进,步证实EB病毒与干燥综台征发病的戈系,作l嚣世计了EB病毒BamW片段特异 的f物和寡核簸探引利用PCR体外基因扩增洼和核酸分于杂交技术出干燥综合征患者外周 血自细胞及唇腺组l中存在有高频率的EB病毒DNA,而对照组的阳性率相对很低.用原位杂交方法 干=釜洲于燥综台征患者辱腺绢织中EB病毒DNA,共28例中有I6例为性结果说明干燥综合征患者 EB前靠感染率较:常人明显增高,且EB病毒感染靶器官的损害有关,提示靶器官控制FB病毒细 胞内复制的免疫机制fJ{现异常. 关键词爱泼斯蛆一巴尔病毒干燥综合祉聚合酶链反应 燥综合征是病因尚未明确的自身免疫性 疾病写耐售勺方法证耍了下礞 综合征患者唾液,腺.肾脏中有EB病毒 DNA的存在1991i年我们设计丁EB病 毒BamW段特异的引物和寡核苷酸探 针l,利用PCR体外基因扩增方法和核酸分 子杂交技术检测干燥综合征患者外周血细胞及 唇腺组织中的EB病毒DNA,并用原位杂交 方法检测r燥综合征患者唇腺组织切片中的 EB病毒DNA 对象和方法 一 ,标本来源 受检原发性干燥综合征患者均符合1986 年Fox等…提出的诊断标准.其中外周血标本 14例,男女之比为1:13,平均年龄4019 岁,平均病程8?5年唇腺活检标本29倒, 男2例,女27例,平均年龄43?18岁,平均 病程为7?5年.对照组标本来自年龄和性别 基本钼配的非干燥综合征的患者及正常人,其 中外周血标本25例,唇腺活检标本14例. Raji细胞是由人Burkitts淋巴瘤组织长 期体外培养建成的EB病毒基因阳’性细胞株. 阴一性对照细胞为单纯疱疹病毒I型(Hsv—I), AD189巨细胞病毒(CMV). 二,标本处理 取新鲜抗凝静脉血的白细胞层或新鲜切碎 的唇腺组织,经细胞溶解缓冲液(MLB)37~ P髑 消化过夜,再始饱和酚,氰仿/异戊醇抽提, 冷乙醇沉淀,真空十燥后,溶于Tris—Hc1, EDTA(TE)缓冲液,一20?保存Raji细胞及 阴性对照病毒的DNA亦同制备后备用. 部分新鲜唇腺组织,以1O%甲醛固定, 作原位杂交用. 三,检测方法 1.重组DNA探针斑点杂交检测EB病毒 DNA:EB病毒基因的BamW片段,长 3072bp,用同位素k32P]dCTP标记.取待检 白细胞,唇腺细胞DNA及Raji细胞DNA, CMVDNA,Hsv—IDNA,分别加入等体积 变一性液室温放置20分钟后点于硝酸纤维膜, JF以8O?烘烤膜2小时,再经常规预杂交, 杂交,洗膜后,一7O?曝光7天,显影,定 影,冲洗,观察. 2PCR技术检测EB病毒DNA:(1)EB 病毒特异性引物(To60,Tc61)和寡核苷酸探针 (Tc62)的合成:引物Tc60:CCAGAGG— TAAGTGGAC不;引物Tc61:GACCG— GTOCC兀?不AGG;探针Tc62:TTCTG cTAAGcccAAC.(2)PCR扩增:将总反应 体系5O1液体加入到0.5ml离心管中,置 DNA扩增仪中,共35次循环扩增 EBVDNA.PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶 电泳分析.溴化乙啶染色确认.(3)PCR产物 变性后经Southern转印或点样于硝酸纤 作者单位:100044北京医科大学人民医院 维膜上,45?预杂交4小州,再加人【Pl dATP标记的寡核苷酸探针,45C杂交12小 时,然后洗膜放射性自影,观察分析结 果. 3原位杂交检测唇腺组织中EB病毒 DNA:唇腺组纵投Raji细胞以石蜡包埋切 片,经0.2mol/L盐酸变性10分钟,用蛋白 酶K37?消化30分钟,脱水.加杂交液37? 过夜,洗片,脱水干燥,再将杂交后切片涂布 核4-乳胶并干燥,密闭于暗盒中,4?曝光3 天,最后显影,定影,观察结果 . 结果 一 , 同位素标记l重组DNA探针斑点杂交 检测标本EB病毒DNA 结果29例于燥综合征患者唇腺活组织中 7例阳性,阳性率24%,l4例患者外周血白 细胞l及对照组25例,经唇活检均为阴性. 二,PCR基因扩增杂交结果 以EB病毒BamW片段和Rajj细胞 DNA为的PCR产物,在分_f量122bP 处可见一阳r性扩增带和杂交信号,而cMV DNA及HSV-IDNA未见任何扩增产物和 杂交信号(图1)干燥综合征29例中新鲜唇活 检组织20例为阳性,阳性率68%;5例唇腺 石蜡包埋组织中3例阳性;l4侧外周血标本 白细胞DNA3例阳性,阳性率21%对照组 14倒中,唇腺组织2倒阳性,阳性率l4%; 25例外周血白细胞中l例阳性,阳性率4%. 经统计学处理,干燥综合征患者后腺组织及外 周血白细胞EB病毒DNA阳性率要高于对照 组,差异有非常显着意义(P<0.01).另患者 EB病毒DNA的阳性率在唇腺组织也较外周 血白细胞为高<001)(图2).’ 三,原位杂交检测唇腺组织EB病毒 DNA 阳性对照Raji细胞中可见密集银颗粒, 阴性对照切片未见任何杂交信号在28例患 者唇腺组织中有16例呵检出EB病毒 DNA,阳性率57%.我们观察到,唇腺组织 腺泡破坏严重者,所址示杂交信号增强,说明 EB病毒基因组含罱高(图3). 沣A:HSV—IB:CMV,C:Ri细胞,D舒量标(PBR 322/Hae[Il 闰18%聚烯酰腾凝胶电浊分析EB病毒基因扩增产物 洼A.E埘j}l{l噼隙甜{织,CF,G.I:患者唇臁组纽 D,H:患者外J瞄血白细胞.BHSV—lJ,RajL细胞K分于 罱标准{PBR322/HaelII) 图2凝胶电泳1展Southern杂交Il讣析r燥综台祉患 者标率EB墒毒基因扩增物 四PCR体系敏感性的测定 PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析,可检测出500fgRaji细胞DNA中的EB 病毒基因,即相当于4个拷贝的EB病毒 DNA i,-l论 干燥综合征患者外周血白细胞及唇腺组织 中存在高频率的EB病毒DNA,说明患者 EB病毒的感染率较一般人群明显增高,而且 在正常人唇腺中也有EB病毒潜伏存在.患者 唇腺组织EB病毒DNA的阳率高_f其外周 中华学志19942月第74卷第2划 血白细胞,这提示l『EB病毒感染j患者靶器 官受损有关.我们以此力法简单特异性强的 原位杂交技术观察了EB病毒DNA在于燥综 合征患者唇腺组织的存在状况,结果发现腺泡 组织破坏严重者,EB蝻毒DNA的含量增 高.这就进一步为EB病毒的活跃复制与干燥 综合征的靶器官癖变密切{f1关提供r更加有利 的证据.EB病毒感染人体后,可以在B淋巴 细胞内潜伏存在.在:常人,EB病毒的复制 处’f:极低的水平,维持在非致病状态.这是由 于人体完备的细胞免疫功能抑制了EB病毒的 结果.EB病毒能够在f燥综合征患者的唾液 腺中活跃复制,说明机体在这部位控制EB 病毒细胞内复制的免疫机制发生r异常. (本文罔3见插页罔第13页j 参考文献 IFoxRI.PeafsonG,VaughanJH,eta】Detectionof EpsteinBarrvirusassociatedantigensandDNALn salivaryglandbiopsiesfrompatientswlIhsjogren’s svndronleJImmuno1.I986,】37:3l62 2柄寤林,张乃峥.曾毅,等EB痫毒与干燥鲸弁的 璃罔关系巾华陡学杂志l99】,71】31 3BaerR,8ankletAT,BigginMDeta】DNAsequeNGe andexpressionoftheBq58Epstein~Barrvirusgenome Nature.】984,10207 r收稿【992一】008修叫:】993l’卜3? (本文编辑:臧焰) 特布他林对血钾影响的评价 孙宁玲丁东杰 特帝他林长期作为支气符张药使用,但它对血 钾的影响一直被人仃】所忽视,本研究探讨了,特布他林 (TER)对血钾的作用. 一 对象j方法 1对象:I7侧健瘴舅年龄2O,30岁,半均 年龄271231岁,受试者在用-rER前,夺腹,卧 位,休息30分钟 2.力癌:(1)采用德国产的TER,Iml{:射液中 含TER05rag(2)每例受试古依次静注5个剂量(每 分钟给25501o0150和200ng/kg)每一剂 量持续静滴15分钟后测定血钾浓度 3血钾测定方法:(1)血钾测定采用德国制造的专 用血钾注射器取血,取血后即剥测定[采用德国生产的 垒自动生化测试仪).(2)?『【钾测定时间:用药前用 药中(每分钟25,50100I50200rig/kg)的5个 剂量用药末发停药后1及2qql,]后. 4.统计学:用检验. 二结果 I用药前血钾浓度(43mmolL)与第1剂量 (25ng,K4lmmol/L),第2剂量(50ng,K39 mmol/L,比较,差异无着意义(P>0.05), 2用药前血钾浓度43retoolL与第3剂昔 【100ng,K一36mmol/L)第4剂量(150ng,K一33 /ILl”I/.l/L)及第5剂量f200ng,K.9retool/L)比 较,差异有非常显着意义f_P<Ooo1) 3用药前血钾(4.25mmol/L)浓崖与停药后l小 叫(K35mmol/L)与2小时(K38mmol/L)比较, 差异有非常显着和显着意义<0.01,P<005) -讨沧 TER是,愕【晾素受体激活剂,作为支气管扩 张药用于治疗支气管哮喘,近年来发现TER对循环 系统可产牛特殊影响而被重视目前更重要的发现是 TER还具有明显的降低血钾的作用本试验从用药 的第3荆量开始(1OOng/kg)血钾发生显着的F降,当 Hj药选第5剂量(200ng/kg)O~血钾半均降可达 I.35retool/L,而且停药后血钾恢复得较缓慢.独们 认为这种现象应引起临床工作者的注意已知n肾 上腺索[标签:快照]