培养细胞常用染色与固定方法

培养细胞常用染色与固定方法 一、普通染色观察 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法， 也是把细胞作为标本保存的主要方法。 对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min，10min)， 弃上清液后(留少量液体)， 将细胞悬液滴于玻片上做成涂片， 冷风吹干。 （一）HE染色法 1、染液配制 (1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g铵矾或钾矾， 0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油， 2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。 (2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液。 2、染色程序 （1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。 （2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。 （3） 入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min， 脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。 （4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。 （5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。 （6）入伊红染液30s～1 min。 （7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次)各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。 （8）用二甲苯透明2次，各5min。 （9）树胶封固。 3、染色结果 细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。 （二）吉姆萨染色法 此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。 1、吉姆萨(Giemsa)染液的配制 （1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。 （2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。 （3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。 2、染色程序 （1）将标本用甲醇固定5～10min。 （2）入吉姆萨液染色10～15min。可用染色缸；或将染液滴覆于标本。 （3）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。 3、染色结果 细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。 瑞氏-吉姆萨染色法 瑞氏染液的配制：称取1㎎瑞氏色素放入研钵中，研磨成粉状，加少量甘油，继续研磨呈一面镜状，加稍多甲醇研磨，配制成600ml染液，转入棕色广口瓶中保存。（封存两个月以上使用，时间越长效果越好） 染色方法： ⑴细胞悬液涂于玻片上，晾干 ⑵用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖 ⑶稍等片刻再加吉姆萨染液2-3滴加减（根据涂片上细胞多少酌情而定） ⑷稍等1-2min后，再加PBS，加时缓慢地一滴一滴加在涂片膜上，直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入，染色30min左右。 ⑸用超纯水缓慢冲洗至少3分钟以上，待干。 二、玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。