一个β-珠蛋白基因1

一个β-珠蛋白基因1 一个β-珠蛋白基因1 南方医科大学2007级硕士学位论文 一个p.珠蛋白基因1.357kb缺失与Y一珠蛋白基因三联体连 锁遗传家系的鉴定 Identificationoftheli kageofp-globingened letionof 1.357kband7-globinge etriplicationinaChinesefamily 课题来源:国家自然科学基金委员会.广东省人民政府自然科学 联合基金重点项目编号:U0632005 专 业 名 称 学位申请人 指 导 教 师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 医学遗传学 娄季武 徐湘民教授 林元藻教授 朱伟杰教授 韦相才教授 罗深秋教授 张文清教授 论文评阅人 朱伟杰教授 白晓春教授 蒋玮莹教授 2010年5月24日广州 L 硕士学位论文 D.珠蛋白基因1.357kb缺失与丫.珠蛋白基因 三联体连锁遗传家系的鉴定 硕士研究生:娄季武 指导教师:徐湘民教授 摘 要 背景与目的 p-地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一。其分子基础是人D.珠 蛋白基因HBB发生突变所致。到目前为止,在世界上不同种族中已发现200余种 D.珠蛋白基因突变。其中,绝大部分是单个碱基替代或者是几个碱基的插入或缺 失,仅有少数一部分突变是p.珠蛋白基因的部分或者全部缺失。在中国南方,尤 其是在广东省和广西省,p.地中海贫血突变具有很高的人群携带率,B.珠蛋白基 因突变类型有将近50种,其中43种足点突变或者小插入或缺失,6种是p.珠蛋白 基因的大片段缺失。 最近,Huang等在一个台湾人携带者中发现了一种新的D-珠蛋白基因缺失一 缺失了1.357kb,该携带者表现为po.地中海贫血杂合子的表型,具有高水平的Hb A2与显著增高的HbF水平。通过分子分析,我们在一个中国大陆家庭中发现五 个成员携带有该类型缺失。有趣的是,携带该缺失的染色体同时携带有3个丫.珠 蛋白基因 .G丫.AGl,.A丫.、I,p.6.13。357?。先证者足连锁等位基因与p+.地中海贫血 .28A?G突变的复合杂合子,其表现为中间型p一地中海贫血TI的表型。通过分 析该家系中携带有连锁等位基因的个体,我们探讨了临床/血液学表型与D.珠蛋 白基因簇基因型之间关系,主要集中在13.珠蛋白基因簇的分子分析和p.珠蛋白基 因mRNA和1,.珠蛋白基因mRNA的定量分析。 中文摘要 材料与方法 研究对象 先证者,是一名1l岁的女孩,来自于中国南方广东省西部的云浮地区。先 证者长期易疲劳,反复褐色尿,黄疸和脾肿大。既往病史示出生正常,没有异 常或延长的新生儿黄疸。8月大时,家人注意到其面色苍白,6岁时,左肋下可 以触到脾脏,并发现逐渐变大。8岁时,先证者表现出如下临床和血液学表型而 被诊断为巾间型B.地巾海贫血:轻度黄疸,身材矮小,脾缘在左肋下4.5cm,但 没有前额突出和肝肿大;实验室检查示小细胞低色素贫血,血红蛋I刍Hb9.0 g/dL,平均红细胞体积MCV65.7fL,平均红细胞血红蛋白量MCH22Pg,红 细胞分布宽度RDW37.7%。血红蛋白电泳发现HbA22.8%,HbF72.3%。肝功 能检测发王见血浆总胆红素丁1.高达49.9I.tmol/L正常范围:6-20,间接胆红素 35.6p,mol/L正常范围:肚14,直接胆红素14.3gmol/L正常范围:0-7l-tmol/L 在接下来的3年里,贫血逐渐加重,血红蛋白由9.0g/dL降低到5.3g/dL, 但先证者的日常生活并没有障碍。11岁的时候,先证者被介绍给我们进行基因 检测。体格检查发现身材矮小,轻度上网皮肤黄染,肝脏轻度肿大,脾脏重度 重大。在这之间,先证者没有输血史。在获得同意后,我们抽取先证者及其16 位家庭成员外周血标本进行此次研究。 血液学方法 红细胞参数分析血常规采用伞自动血细胞计数仪进行检测,HbA、HbA2 孝[IHbF水平的检测采用HPLC技术完成。用酸洗脱的方法检测HbF在红细胞巾分 布,酸件尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于检测G1,、AY、B和Q.珠蛋白链的比例。 DNA分析 基因组DNA的提取采用酚/氯仿方法。Gap.PCR技术和反向点杂交技术分别 用于检测中国人常见d.地rfl海贫血缺失和点突变。11利?巾围人常见B.地巾海贫血 突变的分析采用反向点杂交方法。多重连接依赖探钊+扩增MLPA技术用于检测 D.珠蛋白基因大片段缺失。设计跨越缺失根据MLPA结果的提示的引物用于 硕士学位论文 Gap-PCR扩增整个p一珠蛋白基因及其侧翼序列GenBankAccession NG000007.3。通过对较短片段的测序来确定缺失的精确断裂点。 为了鉴定MLPA结果提示存在的丫.珠蛋白基因重排,我们设计一对引物用于 扩增和丫.珠蛋白基因三联体有关的A~.融合基因,上下游引物分别位于A丫.珠蛋白 基因的上游-499--475bp处和G丫-珠蛋白基因的下游+2191~+2210bp处。正常样由 于引物方向相反而不能扩增出任何片段,但在.G丫.AG丫.A丫三联体样本巾,引物对 可以扩增出特异的对应于AG丫.融合基因的片段。为了鉴别非缺失型HPFH和GY.珠 蛋白基因.158位I拘XmnI酶切位点对HbF-S[。高的影响,我们测序了GY.珠蛋白基因 和A丫.珠蛋白基因的启动予。我们依据已有文献用七个酶切位点分析了6.珠蛋白 基因簇的单倍型。 RNA分析 为了评价D.珠蛋白mRNA和Y.珠蛋白删[?A的表达水平,我们设计了实时荧 光定量反转录PCR实验,采用基于双标准曲线法的定量分析,我们对该家系的4 名连锁等位基因携带者和4名正常人的p一珠蛋mRNA平1y.珠蛋F]mRNA进行了 基因表达水平检测。并用两独立样本,检验来分析缺失与三联体组与正常对照组 之间平均p.珠蛋I刍mRNA相对含量和平均1,.珠蛋白mRNA相对含量的差异。 结果 血液学分析结果 先证者III:1表现为的中间型地巾海贫血表型,具有小细胞低色素贫血Hb 5.3g/dL,MCV67.7fL,MCH20.9Pg,HbAz币l:lHbF_丁I.高分别为5.4%币172.8%, HbF巾G^r.链的比例为55.1%,并且HbF在红细胞巾呈伞细胞分布。另外,其 它8 个家庭成员I:1,I:3,II:1,II:3,II:5,II:6,II:9矛1III:2表现为轻型D.地巾海贫血 的表型且其巾4个母方家庭成员II:5,II:6,II:9和III:2的HbF水平升高 4.3%--11.3%及异细胞分布的HbF,这提示D.缺失遗传自她的母亲。 珠蛋白基因簇的分子分析 分了分析表明先证者是p+一地巾海贫血.28A?G突变和p.珠蛋白基因缺失 中文摘要 的复合杂合子,.28A_?G突变遗传自父亲,缺失遗传自母亲。该家庭成员巾,4 个是.28A?G突变的杂合子,44"是B.珠蛋白基因缺失的杂合子。另外,有三个 成员携带有0【.地中海贫血一?3?7/缺失。 MLPA结果图提示先证者、先证者母亲及其他3个母方成员III:l,II:6,I:3, II:9和III:2的基因组DNA样本中同时存在p.珠蛋白基因缺失和丫.珠蛋白基因重 排。先证者的父亲及另外3个母方成员II:5,II:7,II:1l和 II:3的MLPA结果显示 所有的探针信号正常。 Gap.PCR扩增后异常片段的测序证实存在1.357kb的p一珠蛋白基因缺失:从 Cap位点上游548bp至lJCap位点下游810bp。该缺失年HHuang等报道的台湾型缺失 是同一种缺失类型。利用引物对扩增也证实了在G1,.基因和A丫.基因之间AG丫.融合 基因的存在,这导致了三体化的1,.珠蛋白基因G1,.AGl,.A丫。测序该融合基因.显示 是由A丫.基因的5’端部分与G丫.基因的3’端融合而成,编码区域和G^,.珠蛋白基因一 样。A丫.G丫融合基因被认为是错配染色体之间的交换产生的,并导致丫.珠蛋白基因 三联体的产生:AG丫.融合基因的5’侧翼和3’侧翼分别是一个G1,.基因和一个A丫.基因 .G丫.AG丫.A丫 单倍型分析显示B.珠蛋白基因1.357kb缺失和1,.珠蛋白基因三联体均与单倍 型“+??”连锁,这证明了在这个巾国人家系rflD.珠蛋白基因1.357kb缺失 和1,.珠蛋白基因三联体的连锁遗传 .G丫.AG丫.A丫.、I,p一6一一。357kb。与.28A_G突变 连锁的单倍型是“一++一+一十”,同时我们发现A1,.珠蛋白基因?22522区域的4 bp缺失AGCA与该单倍型连锁,但AG丫一基因启动了的相应区域不存在该小缺失。 实时定量反转录PCR分析显示缺失和三联体组的p.珠蛋白基因mRNA表达 水平显著低于正常对照组f4.413,P0.005,而^r.珠蛋白基凶mRNA表达水平 显著高于正常对照组户2.281,P0.031。 讨论 我们对来自于巾国大陆的一个p一地巾海贫血家系的混合突变等位基因D. 珠蛋白基因缺失和.G^r.AG丫.A丫三联体进行了分子分析。该珠蛋白基因缺陷在一 IV 硕士学位论文 个台湾人携带者中被首次发现,该携带者有典型的轻型p.地中海贫血表型,D. 珠蛋白基因缺失了1.357kb,根据MLPA分析结果,台湾人携带者可能携带有丫. 珠蛋白基因三联体。我们的研究证实了以前的发现并首次鉴定了D.珠蛋白基因 1.357kb缺失与1,.珠蛋白基因三联体连锁遗传。通过Gap.PCR和DNA测序分析, 我们进一步确认丫.珠蛋白基因重排形式为。G丫.AGY.A1,三联体,因此该珠蛋白基 因簇为 .G丫.AG丫.~.、I,p.6.p-1‘357kb。 该连锁等位基因的携带者表现出典型的轻型B.地中海贫血表型,但又都表 现出HbF升高4.3%~11.3%。比较已发表的资料和我们的研究资料,发现台湾 人携带者和我们的携带者具有相似的血液学表型,台湾人携带者也表现为小细 胞低色素、HbF和HbA2升高MCV72.5fL,MCH25.2PgHbF8.9%,HbA2 6.6%。高水平的HbA2、巾度增高的HbF及异细胞分布的HbF提示排除了非 缺失型HPFH及6Bo.地巾海贫血,这为A丫.珠蛋白基因和GY.珠蛋白基因启动了 区测序未见突变所证实。 先证者是连锁等位基因与p+.地rfl海贫血.28A_G突变的复合杂合了,其表 现为巾间型p.地巾海贫血的表型。根据病史,先证者具有典型地中海贫血综合征 的临床表型并像大多数巾间型地巾海贫血病人一样在十岁以前不需要输血。但 是,在过去的三年里,贫血不断加重,血红蛋白由9.0g/dL降N5.3g/dL,并出现 重度脾肿大。先证者的rfl度临床表型可能是由于其独特的基因型所致:B+.地巾 海贫血.28A?G突变可以表达低水平的D.珠蛋白链,而连锁的突变等位基因可 以导致HbFYl‘高。自从ll岁以后,先证者表现出严重的临床症状病,需要定期 输血。这可能和严重的脾功能亢进有关。 四个.G丫.AG丫.A丫.D。’357?。地rfl海贫血杂合了的显著.丁I.高的HbF应该主要归 因于包括启动了在内的p.珠蛋白基因大片段缺失,该缺失导致丫.珠蛋白基 因表达 增加。D.珠蛋白基因大片段缺失可以改变染色质结构及丫.珠蛋白基因启动了与 LCR、有限的转录因了的竞争作用,在p.珠蛋白基因启动了缺失的情况下,^r.珠 蛋白基因可以与LCR更好的作用。另外,与B.珠蛋白基因缺失连锁的1,.珠蛋白基 V 中文摘要 因三联体.G丫.AG丫.A丫也可能贡献了先证者HbF的高表达,虽然以前的研究表明携 带有改型三联体的成人表现出正常水平的HbF和G1,.链比例。和四个杂合了相比, 先证者的G1,.链比例更高55.1%,这表明额外的AG丫.融合基因可能有一定程度的 表达;这个现象揭示显著增加的1,.链可能有赖于个体的贫血状况。在本研究中, 我们没有发现oY.基因.158的‰胛I位点的作用。 这是首次鉴定p.珠蛋白基因缺失与丫.珠蛋白基因三联体连锁遗传;两者的遗 传连锁可能是由不同时间发生于同一个染色体上的两个独立事件非同源重组 和不等交换所致。比对D.珠蛋白基因缺失位点5’、3’端的序列和相应正常序列 没有发现有同源性。但在5’断裂点附近发现存在有和非同源重组有关的重复AT 序列,因此,可能是非同源重组事件导致了D.珠蛋白基因缺失。.Gy_AGy.A丫三联 体可能产生于AY.珠蛋白基因.271位点与G丫.珠蛋白基因136号密码了之间的不等 交换。但是,由于两个基因高度同源,很难确定精确地交换位点。对D.珠蛋白基 因缺失和^r.珠蛋白基因三联体连锁的进一步的研究会有利于阐明人Y.珠蛋 白基冈的调控机制。 关键词 巾间型p.地巾海贫血p.珠蛋白基因缺失AG丫.融合基因^r.珠蛋白基 因三联体 VI 硕士学位论文 Identificationoftheli kageofp-globin gened letionof1.357kbandy-globingene triplicationinaChin;efamlytrl lication esel Name:LouJi.Wu Supervisor:Prof.XuXiang??Min BackgroundandObjective ABSTRACT lB-thalassemiaisoneofthemostcommonmo ogenicdiseasesworldwide.This inheritedhemoglobindisorderiscausedbymutationsnthehuman13-globinge e HBB.Uptillnow,overtwohundred13-thalassemiamutationshavebeenidentified inthedifferentpopulationsfromendemicregionsfthisdisorderaroundworld. Amongthem,thevastmajorityofdisease?causingm tationsaresinglebase substitutionsandinsertionsordeletionsofafewnucleotides,andonlyafewforms arecontributedypartialorcompletedel tionsofthe13-globingene.Insouthern China,especiallyinGuangdongandGuangxiProvinces,thereisa ighcarrier prevalenceof13-thalassemia,withshowingnearly5013-thalassemiaallelesincluding 43typesofpointmutationsorsmalldeletions/insertionsand6 typesofgross deletionsntheouthernChi ese. Recently,Huangandcolleaguesreposedanovel13-globingenedeletionof1.357 kbinaTaiwanesecarrieLwhohada130-thalassemiaphenotypewithunusuallyhigh levelsofHbA2andmarkedlyincreasedHbF.Inthistudy.wealsoidentifiedthis formofthedeletioninfivemembersofamainlandChinesefamilyb molecular analysis.Interestingly,thechromosomewiththisdeletionalformofthe13-thalassemia wasconfirmedtocarrythreey-globingenes .G丫.AG^r.A丫.Vp.8.p一 1?357。6.Interaction ABSTRACT ofthislinkedmutantgenewiththe13+-thalassemiallele.28A?Gintheaffected probandproducedaphenotypeoffl-thalassemiaintermediaTI.Wehaveassessed correlationbetweentheclinical/hematologicalphenotypeand13-globincluster genotypeinthindividualswiththeunusualdefectsfromthisfamily,focusednboth themolecularanalysisofthedefective13-globingeneclusterandthemeasurememof the13-mRNAandT-mRNAlevels. MateriaissandMethods Subjects Theproband,an11-year?oldgirl,belongst aChinesefamilythatoriginatedfrom Yunfucounty,westofGuangdongProvinceinsouthemChina.Shehadahistoryf fatigue,recurrentda k-coloredurine,jaundicea dsplenomegaly.Herpastmedical historyshowedthatshewasbomnormally,withoutexaggeratedorprolonged neonataljaundiceandwasnoticedwithanabnormallypa efaceat8monthsofage. At6yearsold,herspleenwaspalpatedb lowtheleftcostalndenlargedgra ually. Shewasdiagnosedasp-thalassemiaintermediaTIat8yearsofageaccordingtothe followingclinicalandhematologicalphenotypes:shepre entedwithaslightjaundice, shorts ature,butnofrontalbossingorhepatomegaly.Herspleentipwaspalpated4.5 cmbelowtheleftcostalmargin.Laboratoryevaluationrevealedhypochromic microcyticanemiaw thahemoglobinHblevelof9.0g/dL,ameancellvolume MCVof65.7fL,ameancellhemoglobinMCHof22Pgandaredcell distributionwidthRDWof37.7%.HbelectrophoresisshowedahemoglobinA2Hb A2levelof2.8%,andahemoglobinfetalHbFlevelof72-3%.Hepaticfunction testsshowedthathertotalserumbilirubinwaselevateda 49.9txmol/Lnormalrange: 6-20,indirectb lirubin35.6lamol/Lnormalrange:o_14,directbilirubin14.3 pmol/Lnormalrange:o_7. Duringthesubsequent3years,heranemiaprogressedwithgraduallydecreasing 硕士学位论文 levelsofHbfrom9.0g/dLto5.3g/dL,butshedidnotexperiencea yproblemsin herdailyife.ShewasreferredtoUSforgeneticestingat1 1 yearsofage.Upon examination,sheshowedaproportionalshorts ature,aslightskinyellowing,amild hepatomegaly,andaseveresplenomegaly,butsheneverreceivedabloodtransfusion beforevisitingUSforconfirmativediagnosisthistime.Obtainedthefamily’Sconsent, wecollectedperipheralbloodsamplesfrom17 familymembersf omthree generationsforthistudy. HematologicMethods Hematologicalparameterswe emeasuredbyanautomatedcellcountinga d theHbA,HbA2andHbFlevelsweremeasuredwithanautomaticHPLCsystem. ThedistributionofHbFinerythrocyteswasas essedbyanacidelutionmethod.The relativeproportionofG丫,A 丫,pandu.chainsweredeterminedbyacid.urea polyacrylamidegelelectrophoresis. DNAanalysis GenomicDNAwasextractedfromalltheperipheralbloodsamplesaccordingtO standardlaboratoryproceduressingaphenol/chloroformmethod.Theknown Chinesea-thalassemiadeletionsandpointmutationsweregenotypedusingGap?PCR andtheRDBassay,respectively.The11 known13-thalassemiamutationsinthe ChinesepopulationwereidentifiedbytheRDBassay.Multiplexligation?dependent probeamplificationMLPAWasusedtodetectthe13-globingenegrossdeletions.A primerpairthatspansthepresumeddeletionindicatedbytheMLPAtypingpat tern wasdesignedtoamplifythentire13-globingeneanditsflankingsequenceGenBank AccessionNG_000007.3byusingGap-PCRassay.Theexcisionbreakpointofthis deletionwasfurthercharacterizedbysequencingoftheproperPCRproducts. Inordertodefinethe,-globingenerearrangementsuggestedbytheMLPA profiling.wedesignedaprimerpairtoamplifytheAG,-hybridgenethatisinvolvedin ABSTRACT thetriplicated?-globingene,theupperp imerisattheposition一 499to?475nt upstreamoftheCapsiteoftheA?-globingene,andthelowerp imerisatthe position+2191 to+2210ntdownstreamoftheCapsiteoftheu?-globingene.By PCRdetectionusi gthesetwoprimers,wecouldnotamplifyandetectableproduct inanormalDNAsample,whileproducedanamplifiedragmentspecificforthe AG?-hybridgeneinthesamplewiththe?-globingenetriplication.Sequencingofthe promoterregionsfboththe~.globinandtheG?-globingenewascarriedouto identifythenondeletionalHPFHor6p?thalassemiadeterminantssincethevariations occurredatthesetwopromotersincludingthepolymorphismofXmnIiteatposition ?158intheu?-globingenewerer portedlyassociatedwithlevatedlevelsofHbF. Haplotypeanalysisofthe13-globinge eclusterwasperformedusingseven polymorphicsitesa describedbY JLeeta1. RNAanalysis Wedesignareal?-timequantitativereverse-?transcriptPCRasaaytoevaluatethe expressionlevelof13-globingenemRNAand3t-globinge emRNAindeletionand triplicationcarriers.Onthebasisoftwostandardcurvesmethod,wecalculatethe mean13-globingenemRNAand7-globinge emRNArelativeconcentrationinfour mutationcarriersandfournormalindividuals。Thediffer nceofmean13-globingene mRNAand?-globingenemRNArelativeconcentrationbeweendeletionand triplicationcarriersg oupsandnormalcontrolgroupwereanalysisbythe independentsamplesttestusingstatisticalsoftwareSPSS,version13.0. Results Hematologicaldataan lysis TheprobandIII:1wasfoundtoh veaTIphenotypewithahypochromic microcyticanemiaHb5.3g/dL,MCV67.7fLandMCH20.9Pg,5.4%HbA2, thedistributionofHbFinherRBC 硕士学位论文 appearedtobepancellular.Inaddition,hereighto herfamilymembersI:l,I:3,II:1, II:3,II:5,II:6,II:9andIII:2showedematologicalfeaturesof13-thalassemiatraits andfourofthemI:3,II:6,II:9andII:2werepresentingelevatedlevelsofHbF rangefrom4.3%to11.3%andheterocellulardistributionofHbF.suggestingthatthe 13-globingrossdeletionwasinheritedfromhermother. MolecularanalysisoftheIj-globinge ecluster TheresultsofgenotypingofDNAsamplesinthisfamilyweresummarizedinth lastworightmostc lumnsofTable1 andFigure1.Theresultsindicatedthathe probandwasacompoundheterozygotewithfl+-thalassemia.28A_Gmutationand 13-globingrossdeletion,inwhich-28A?Gwasinheritedfromhisfatherand 13-globingrossdeletionwasinheritedfromhismother.Atotalofeight13-thalassemia heterozygotescomposedofeachhalfofallcarders、析 ththeabovetwodefectswere identifiedinthisfamily.Besides,threefamilymemb rsI:4,II:7andII:1 were foundtocarrythesilent一123.7/allele. TheMLPAprofilingpatternsoftheproband,hermotherandotherthree matrilinealmembersIll:1,II:6,I:3,II:9andII :2showedb ththepresenceofa grossdeletionofthe13-globingeneandofatriplicated1,-globingenearrangementin theirgenomicDNAsamples.HerfatherandotherthreematrilinealmembersII:5, II:7,II:11andIII:3showedthenormalsignalheightsforallprobes. Gap?PCRfollowedbysequencinganalysisofabnormalDNAfragments,thatpan thebreakpointofthepresumeddeletionrevealeda1.357-kb13-globingenedeletion startingfrom-548bptO+810bprelativetotheCapsite,thatisthesameasTaiwan deletionreportedpreviouslybyHuangeta1.ThePCRdetectionusi gAG?FP/AG-RP primerpairconfirmedthatpresenceoftheAG7-hybridgenelocatedbetweentheG1, geneandtheA丫gene,generatingatriplicatedy-globinge earrangementG丫一AG^r-A1t. Thedetailedsequenceanalysisofthisnew7-globinge esuggestedthathis V ABSTRACT AG-t-hybridgenewasgeneratedfromfusedoftheAy-globingeneatthe5’reg ionand theGy-globingeneatthe3’region.Theentirecodingregionwasidenticalt o Gy-globingene.ItwaspresumedthatheA丫.G丫hybridAC 丫.hybridwascreatedfrom acrossoverbetweenmismatchedromosomesthatproduceday-globinge e triplicationwitha AGl,-hybridgeneflanked5’byaG1,-genea d3’byanAy-gene .G丫.AGl,.A丫. Thefamily-basedhaplotypeanalysisshowedthatallfivemembersI:3,II:6,II:9, III:1andIII:2whocarriedbotha 1.357kb13-globinge edeletionanda heterozygous1,-globingenetriplicationwereidentifiedas“+一一一一一 一”.thus confirmingthatthedeletionandtriplicationareonthesamechromosome.Therefore, weidentifiedthlinkageof13-globingenedeletionof1.357kband7-globinge e triplication .GPG丫.A丫.、I,p.6.旷1?357曲 inthisChinesefamily.Thehaplotypelinked tothe一28A??Gwas“一++一+一+”,anda4-bpdeletionAGCAatposition一 225 to.222ntoftheA丫 globinpromoterischaracteristicofthishaplotype,butthissmall deletionwasn’tseeni theAG7-globinpromoter. Real-timequantitativePCRshowedthemeanrelative13-globinmRNA concentrationinthe1.357kbdeletionand1,-globinge etriplicationgroupwere significantlowerthani thenormalcontrolgroupp4.413,尸 _0.005.However,the meanrelative7-mRNAconcentrationw smarkedlyhigherinthe1.357kbdeletion andy-globinge etriplicationgroupthaninthenormalcontrolgroupt。 2.281, P0.031. Discussions Inthistudy,wehaveperformedthemolecularanalysisofthecompositemu ant allelethatinvolvesa13-globingrossdeletionanday-globinge etriplication .G丫.AG丫.A丫 observedinamainlandChinesefamilywith13-thalassaemia.This [3-globingenedefectswasfirstlydescribednaTaiwanesecarrierwhohadaclassical 13-thalassemiatrait,showinga1.357一kb13-globinge edeletiondenominateda Taiwanesed l tionandapossible7-globinge etriplicationbasedontheMLPA 硕士学位论文 analysis.Ourpresentworkconfirmedtheirp eviousfindingsandfirstlyidentified thathe1.357-kbp-globingenedeletionanday-globintr plicationreonthesame chromosomebya family?basedhaplotypeanalysis.Furthermore,wehave characterizedthey-globinge erearrangementasth .G丫.AG 丫.A1,triplicationus ng Gap?PCRfollowedbyDNAsequenceanalysis.Therefore,theD-globingencluster boredthiscompositeallelecouldberecordedas .GPG丫.A丫.v13.6.p一 ‘35张b. Thecarrierswiththecompositemu antalleleshowedthetypicalh ematological phenotypesofa13-thalassaemiatraitexceptforoneswithincreasedlevelsofHbF rangefrom4.3%to11.3%parisonofourdatawitht atpreviouslyreportedfor onecarrierwitht isdefectivegenrevealedthsimilarhematologicalphenotypesin theheterozygote,whoalsohadhypochromicmicrocytosisandelevatedHbFandHb A2levelsMCV72.5fL,MCH25.2Pg,HbF8.9%andHbA26.6%.Theblood phenotypingofh ghlevelsofHbA2,amodestelevationofHbF,andheterocellular distributionofF-cellssuggestedthexclusionofnon?deletional6pu-thalassemiaand HPFHforourcases,whichis naccordancewiththeresultsofnomutations identifiedinthepromoterregionsofboththeAy-globinandtheGy-globingeneby DNAsequencinganalysis. Interactionofthiscompositemu antallelewiththep+-thalassemiaallele.28 A?GintheprobandgaverisetoaTIphenotypeforourproband.Accordingtothe proband’Smedicalhistory,shemanif stedaclinicalphenotypeofclassicthalassemic syndromesandidnotrequireatransfusiona m stTIpatientsduringherfirst10 years.However,heranemiaprogressedwithgraduallydecreasinglevelsofHbfrom 9.0g/dLto5.3g/dLandhavingaseveresplenomegalyforthepastthreey ars.Her modestclinicalphenotypesshouldbeattributedtoh runiquecausativegenotype, whichinvolvedgeneticfactorsbothof13+-thalassemialleleforexpressinglowlevels of13-globinchainsandofthislinkedmutantalleleforsomecompensatoryHbF.She hashownsevereclinicalsymptomsandrequiredregularbloodtransfusionsinceshe was11 yearsofage.Hersevereclinicalconditionm ghtbeassociatedwithasevere VIl ABSTRACT splenomegalywithhypersplenism. ThemarkedlyhighlevelsofHbFinthefour.G 了.AGY-AT.[,-1.357kb_thalassemia heterozygotessh uldmainlybeattributedto heincreasedexpressionof'-globin genescausedbyp-globinge egrossdeletionincludingthepromoterregion,which alteredchromatins ructureandcompetitionwiththeremaining'-globingene promotersforlimitedransactingfactorsandtheLCR.The'-globingenecompetes morefavorablyforinteractionwiththeLCRintheabsenceofthep-genepromoter.In addition,the'-globingenetripl cation.G丫.AG丫.A丫 linkedtothe13-globingross deletionmightcontributetothelevatedleveloflibFinthechildprobandalthough previousavailablestudiesshowedthatadultswithasingle'-globintriplicationhad normallevelsofHbFandlowu,-chainvalues.Theaff ctedprobandhaahigher u,-chainvalue55.1%thanthaofthefourheterozygotes,suggestingthathe additionalAG'-hybridgenecouldproduceG,-chainstosomed gree;thisp enomenon revealedthathegreatlyincreasedpro uctionofthe'-chainoulddependonthe anemicconditionofthesubject.Moreover,ther leoftheXmnIsitesatposition-158 oftheu7-globingenecouldberuledoutaccordingto urobservation. Thisisthefirstlyidentifiedreportofap-globingrossdeletionlinkedtoa '-globinge etriplication;theirgenet clinkagewouldresultfromthetwo independentev tsnon-h