D_半胱氨酸盐酸盐制备研究

收稿日期 : 2006 - 11 - 09 作者简介 :周锡樑 ,男 (1946 - ) 教授 D -半胱氨酸盐酸盐制备研究 周锡樑 1, 2,梅亚红 2 ,兰荣华 2 ,颜素珍 2 ,刘 　娟 2 ,刘 　婷 2 (1. 深圳大学 , 深圳 518060; 2. 武汉麦可贝斯生物科技有限公司 ,武汉 430056) 摘要 : D -半胱氨酸盐是手性药物 ,主要是第三代头孢抗生素药物 —头孢米诺钠的重要中间体。本文介绍了 D - 半胱氨 酸盐酸盐的研制。采用 L -半胱氨酸盐酸盐为出发原料 ,经消旋、沉淀异构体、结晶分离、提纯的 ,制成达到日本味之素公 司 1997年公布的产品质量指标的 D -半胱氨酸盐酸盐。 关键词 : D -半胱氨酸盐酸盐 ; D -氨基酸 ;制备 中图分类号 : TQ464. 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1006 - 8376 (2007) 01 - 0039 - 03 　　随着世界范围内手性药物市场的快速发展 ,作 为其重要中间体的 D 型氨基酸的需求量骤增。目 前 ,国内除 D - 对羟基苯甘氨酸 (阿莫西林的原料 ) 大规模生产外 ,其它 D 型氨基酸并无批量生产。因 此研究 D 氨基酸的制备 ,开发经济可行的生产工 艺 ,已成为中间体研究的热点。 D -半胱氨酸盐酸盐是手性药物第三代头孢抗 生素药物 —头孢米诺钠的重要中间体。目前国内已 有数家药厂取得了头孢米诺钠的卫生部的批文 ,正 投入生产。但 D - 半胱氨酸盐还只能依靠进口 ,价 格昂贵。除此之外 ,根据国外文献资料报道 , D - 半 胱氨酸盐还是大肠杆菌的强抑制剂 [ 1 ] ;急性酒精中 毒的缓解剂 [ 2 ]。因此 D -半胱氨酸盐有其十分重要 的用途。 D -半胱氨酸盐酸盐的制备工艺比较复杂 ,采 用不对称合成方法制备 ,反应步骤比较多 ,生产控制 难度大 ,需要使用价值昂贵的对映体试剂 ;酶法拆分 虽然反应条件温和 (通常在 20℃～30℃) ,位点选择 性强 ,副反应少 ,收率高 ,光学纯度高 ( 100%对映体 过剩 ) ,但制备活性高、纯度高的酶 ,存在技术难度 大 ,成本高的问题。所以这两种制备方法均难以实 现大生产。而且 D -半胱氨酸盐酸盐的合成还由于 其分子结构的特殊性 ,选择通常的制备方法是很难 成功的。正因为这些原因 ,据我们了解 ,目前世界上 可供应此产品的公司也不很多。而据武汉市科学技 术情报研究所查新检索中心的“科技查新 ”,国 内还没有文献资料报道此产品的生产。因此研究此 产品的生产有很大意义。 1材料与方法 1. 1材料 L -半胱氨酸盐酸盐 ,有机溶剂 (冰乙酸、乙醇 等 ) ,手性沉淀剂。 1. 2制备工艺路线 2结果与讨论 2. 1出发原料的选择 制备 D -半胱氨酸盐 ,可用的出发原料不少 , L -胱氨酸、DL -胱氨酸、L -半胱氨酸盐酸盐、N - 乙 酰 - L -半胱氨酸、DL - 半胱氨酸盐酸盐等。我们 从制备成本考虑 ,选择了 L - 胱氨酸为出发原料 ,按 照文献资料介绍的方法 [ 3 ]进行实验 ,发现工艺可行 性极低。在碱性条件下回流 ,巯基键发生断裂 ,且回 流时间越长 ,断裂越多。在碱性条件下生成水溶性 多硫化钠。加酸后生成难溶的胶态硫 ,产品很难结 晶。以硫酸消旋 L - 胱氨酸 ,所得的产品虽然是旋 光为 0的结晶 ,但继续进行下去 ,却很难获得 N - 乙 酰 - DL - 胱氨酸。根据文献报道的实验结果 , [ 4, 5 ] 我们也认为由于胱氨酸有两个不对称碳原子 ,在消 旋过程 ,产生了内消旋体和外消旋体两种结构 ,而两 种消旋体混合在一起是很难结晶的。从文献 [ 6, 7 ] 中可以发现内消旋体和外消旋体的红外图谱与晶型 图差别是很大的 ,所以从 L - 胱氨酸出发制备 D - 半胱氨酸盐酸盐 ,必须获得完全外消旋体的 DL - 胱 氨基酸和生物资源　2007, 28 (1) : 39～41 Am ino Acids & B iotic R esources 氨酸。图 1和图 2为 DL - 胱氨酸外消旋体和内消 旋体的晶型图 [ 6 ]。 图 1外消旋体 DL -胱氨酸 　图 2内消旋体 DL -胱氨酸 按文献 [ 6 ]介绍的方法分离两种消旋体 ,虽然 可以获得接近文献值的外消旋 DL -胱氨酸 ,从残液 中收回的 DL - 胱氨酸 ,也证明是内消旋 DL - 胱氨 酸 (见 1)。但是工艺复杂 ,收率低。进行工业生 产的可行性不大。 表 1消旋胱氨酸熔点实验值与文献值对照 产品名称 文献值 [ 6, 8 ] 检测值 外消旋体胱氨酸 260℃ 内消旋体胱氨酸 200～218℃ 实验制备消旋胱氨酸 231. 4℃ 重精制的消旋胱氨酸 239. 8～258℃ 残液中结晶的胱氨酸 214. 9～215. 3℃ 改用 DL - 半胱氨酸盐为出发原料 ,考虑 DL - 胱氨酸通过电解反应 ,能否发生分子重排 ,但实验的 最终产品收率证明 ,用非纯化外消旋的 DL - 胱氨酸 电解而获得的 DL -半胱氨酸盐 ,其熔点与文献值还 是不同。其结果见表 2、表 3 表 2购买的半胱氨酸产品熔点检测值对照 产品名称 文献值 购买产品检测值 DL - 半胱氨酸盐酸盐 140～141℃ 146～151. 8℃ DL - 半胱氨酸 225℃ 220. 0～220. 6℃ L - 半胱氨酸盐酸盐 175～178℃ 175. 2～175. 5℃ 表 3用本文方法制备的 DL半胱氨酸及盐的熔点 产品名称 文献值 制备产品检测值 DL - 半胱氨酸盐酸盐 140～141℃ 140. 2°～141℃ DL - 半胱氨酸 225℃ 223. 6℃～224℃ 通过实验证明以 L - 半胱氨酸盐为出发原料 , 只要解决消旋过程的问题 ,就可以获得品质高的 D -半胱氨酸盐。 2. 2　消旋条件的选择 在确定以 L - 半胱氨酸盐酸盐等为出发原料 后 ,进一步对其消旋条件进行实验。 根据氨基酸消旋化的结构理论 , L -α - 氨基酸 在发生消旋化时 ,分子中的α - 碳原子构型由 SP3 杂化构型共振为 SP2 杂化构型后 ,再重新返回 SP3 杂化构型 ,部分构型会发生翻转 ,形成 D -α - 氨基 酸。有关的研究报告也证明了此理论。[ 9, 10 ]从 L -α -构型的氨基酸出发制备 D -α -构型的氨基酸 ,必 须在消旋化过程使更多的 L -α -构型“发生翻转 ”。 而消旋化反应是与反应温度、时间有关。表 4是本 研究进行消旋化反应 ,产品比旋光为 0 ±0. 02时 ,反 应温度与反应时间的变化。 表 4消旋化反应与温度、时间关系 实验批号 1 2 3 4 反应温度 /℃ 40 50 60 90 反应时间 / h 10 6. 5 4. 5 2. 5 比旋光 [α] 0 0. 02 0. 16 0 消旋液颜色 柠檬黄 浅黄色 黄色 浅黄色 制备过程发现 ,消旋温度低时间长 ,但产品收率 没有比高温消旋显著增加。从工业生产的工艺时间 考虑 ,我们选用了 90℃的工艺。 2. 3　拆分材料的选择 关于 DL -氨基酸的拆分方法报道很多。实验 中首先选择了氨基酰化酶的拆分方法。按参考文献 [ 11～15 ] 的方法 ,我们制备了比旋光度、熔点都达 到文献报道的 D - 半胱氨酸产品 (M. P 176. 3。)。 但是在制备过程我们发现有几个难点。①制备纯化 的氨基酰化酶很麻烦 ,而使用按文献报道方法制备 的粗酶 ,每次实验使用量均有变化 ; ②酶拆分后的产 物纯度不高 ,给 D -半胱氨酸的纯化带来困难 ; ③消 旋液酶拆分前需调 pH,在弱碱性环境 ,很容易导致 半胱氨酸的氧化。这些都是工业化生产中的难题 , 特别是解决制备氨基酰化酶所需要的大量新鲜猪 肾、冷冻条件、设备等问题 ,普通生产厂是比较困难 的。 参考了众多文献 [ 16～20 ]后 ,我们选择了不对称转 换方法进行 D -半胱氨酸盐制备。经对多种拆分剂 的筛选 ,最后选用了效果较好的拆分剂 ,并制备成功 与文献值熔点和比旋光接近的中间体 (见表 5)。 以上中间体经结晶分离、提纯 ,均制备成功达到 日本味之素公司 1997年公布的产品质量指标的 D -半胱氨酸盐酸盐。 ·04· 周锡樑等 : D - 半胱氨酸盐酸盐制备研究 表 5中间体熔点、比旋光实验值与文献值 实验产品批次 熔点 /℃ 比旋光 [α] 172～1743 - 81. 83 1 162. 3～163 - 83. 8 2 162. 7～163. 5 - 83. 6 3 163. 6～163. 8 - 81. 4 4 162. 6～163 - 84. 6 5 164. 1～164. 5 - 79. 6 注 : 3 文献值 3　结论 采用 L - 半胱氨酸盐酸盐为出发原料 ,按本研 究的制备方法 ,可获得达到日本味之素公司 1997年 公布的产品质量指标的 D -半胱氨酸盐酸盐。同时 还可避免采用非外消旋体 DL - 胱氨酸制成的 DL - 半胱氨酸盐为原料 ,对 D - 半胱氨酸盐产品晶体和 熔点的影响。 参考文献 : [ 1 ] 　Julie Soutourina, Sylvain B lanquet, and Pierre Plateau. Role of D - Cysteine Desulfhydrase in the Adap tation of Escherichia coli to D - Cysteine [ J〗. J. B iol. 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L - cysteine hydrochloride monohydrate was used as the first raw material, after racem ization, p recip itation and separation , and so on, D - cysteine hydrochloride monohydrate (AJ I97) was obtained. Key words:D - cysteine hydrochloride monohydrate; D - am ino acid; synthesis ·14·氨基酸和生物资源