红细胞内血红蛋白相互作用研究进展

2012年第28卷第4期 Vo1．28 No．4 2012 包 头 医 学 院 学 报 JoURNAL oF BAoToU MEDICAL CoLLEGE 119 红细胞 内血红蛋白相互作用研究进展 刘瑞刚 苏 燕 (包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古 包头014060) 血红蛋白(hemoglobin，Hb)是红细胞的主要组成成分，是红 细胞运输氧气的主要执行者。在人体数万种蛋白质中，Hb一直 作为描述蛋白质结构以及结构与功能关系的重要范例而被广泛 和相当透彻地研究。然而在活细胞中，蛋白质并不是独立地完 成被赋予的功能，它们通常与其它蛋白质相互作用形成复合体， 进而在特定的时间和空间内完成特定的功能。研究红细胞内 Hb相互作用是最终阐明红细胞携氧及抗氧化功能的关键所在。 1 红细胞的蛋白质组成 由于成熟红细胞内没有细胞核和内膜系统，因此红细胞内 的蛋白主要分为膜蛋白、膜骨架及胞浆蛋白。胞浆蛋白中 Hb的 丰度最高，几乎占红细胞干重的 35％，其次为碳酸酐酶和硫氧 还蛋白过氧化物酶。此外 ，红细胞的胞浆中还含有丰富的抗氧 化酶，用来抵抗红细胞携氧引起的氧化应激对红细胞的损伤。 膜蛋白分为内在蛋白和外周蛋白以及脂锚定蛋白，主要包括带 3 蛋白(Band 3)与血型糖蛋白。膜骨架指细胞膜下与膜蛋白相连 的由纤维蛋白组成的网架结构，它参与维持质膜的形状并协助 质膜完成多种生理功能。膜骨架蛋白主要包括血影蛋白、肌动 蛋白、锚蛋白和带4．1蛋白(Band4．1)等。近年随着蛋白质组学 和互作组学的发展，科学家们开始研究并公布了一些高通量红 细胞蛋 白质组学和红细胞膜蛋白质组学的数据和资料。 2002年，Low等 首次利用双向1EF—SDS—PAGE分离红细胞 膜蛋白，鉴定出 102种膜蛋白。2006年，Pasini等 利用四极杆 一 飞行时间串联质谱仪(Q—TOF)和热电混合线性离子阱傅立 叶变换质谱(LTQ —b-TMS)，鉴别出566种蛋白，其中包括 314种膜蛋白和 252种可溶性蛋白。随着肽配体库(peptide lig_ and libraries)的发展 ，2008年，Roux—DMvm等 通过快速和高 通量的 Orbitrap MS分析，成功鉴定出 1 578种红细胞胞质蛋白。 2 Hb的结构与功能 Hb是由4个亚基组成的四聚体蛋白，分子量为 64 kD。各 种 Hb均由两条相同的 仅链家族亚基(仪和 ‘，141 aa)和两条相 同的 B链家族亚基(B、 、8、和 ￡，146 aa)构成。正常成人红细胞 主要包含三种 Hb，即 HbA(a2B2，约占 95％ 一98％)、HbA2 ( ，约占2％ ～3％)及 HbF( 2，约占 1％)。Hb的主要 功能是运输氧气，维持血液酸碱平衡。Hb在红细胞 内主要以游 基金项目：教育部科学技术研究重点项目(210039)；国家 自然科学基 金(81160214)；内蒙古自治区高等学校科学技术研究重点 项 目(NJ09157)；内蒙古自然科学基金(2010BS1101) 通讯作者 ：苏燕 离状态存在，也有小部分与红细胞膜或细胞骨架蛋白结合，从而 影响红细胞的许多特性，如膜流动性、离子通透性、变形性等。 3 Hb相互作用的研究方法 随着蛋白质组学的迅速发展 ，蛋白质相互作用已成为蛋白 质组学研究的热点，蛋白质相互作用的研究方法也在不断地发 展和完善。研究蛋白质相互作用的传统方法有很多，包括酵母 双杂交 、串联亲和纯化 、免疫共沉淀 、蛋白芯片以及基于生物信 息学的分析方法等。但由于成熟红细胞不能表达蛋白，所以通 常所用的串联亲和纯化等体内研究红细胞蛋白质相互作用的 策略受到很大的限制，因此在高通量红细胞蛋 白质组数据得到 后，这些蛋白质之间的相互作用主要通过生物信息学的预测。 目前，多种蛋白质相互作用的研究方法并存 ，不同研究方法相 互印证 ，仍旧是研究 Hb相互作用的主要方法。此外，由于 Hb 在红细胞内丰度很高，实验中如何避免 Hb对其它低丰度蛋 白 的掩盖也成为研究者遇到的最大问题。包头医学院Hb研究室 首次建立了活态红细胞电泳释放技术，并通过与双 向电泳或 SDS—PAGE以及质谱检测相联用来发掘红细胞内蛋 白质相互 作用。通过此项技术 ，已经发现 Hb可以与硫氧还蛋白过氧化 物酶、碳酸酐酶及血影蛋白之间发生相互作用 。 4 Hb与其他蛋白的相互作用 4．1 Hb与带 3蛋白的相互作用 带 3蛋白又称人阴离子交 换蛋白 1(Anion Exchanger l，AE1)，约 占红细胞膜蛋白含量的 25％。带 3蛋 白由两个相 同的亚基组成，主要介导 C1一和 HCO；的跨膜交换 ，利于红细胞吸收 CO：并将其转化为 H 和 水，同时将 HCO；转运出细胞。W~der JA 研究发现，带 3蛋 白主要和脱氧Hb结合，结合点位于脱氧 Hb表面由两条 8链 构成的“小穴”中。如果将 Hb氧化或将其 B链交联，带 3蛋 白 胞质段氨基端就不能与其结合。不同状态的 Hb与带 3蛋白相 互作用的亲和力是不同的，脱氧 Hb比氧合 Hb与带3蛋白的相 互作用力强 ]。Hb与氧的结合状态能够调节 Hh与带 3蛋 白 之间的相互作用，进而改变带 3蛋 白的结构，使其阴离子通道 的通透性改变，从而维持 O 和 CO：的气体交换平衡。同时， Hb与带 3蛋白的相互作用也参与调节红细胞的变形性。脱氧 Hb可以与糖酵解酶竞争性结合带 3蛋白的结合位点，因此 ，胞 内氧气浓度可以间接调控糖酵解酶活性，从而调控胞内能量代 谢水平H 。此外 ，Hb与带 3蛋白的结合很可能参与了信号分 子 NO的定向传递。生理条件下，NO通过扩散 的方式进入红 细胞与 Hb结合，然后 Hb与带3蛋白结合，NO因此被传递到 带 3蛋白上，最后通过带 3蛋白将 NO转运到红细胞外⋯ 。 120 包 头 医 学 院 学 报 第 28卷 4．2 Hb与 Hb的相互作用 正常成人 Hb包括 HbA、HbF和 HbA2。在上世纪后叶，科学家进行了大量实验来研究不同 Hb 亚基之间的相互作用。秦文斌利用淀粉琼脂糖凝胶电泳进行 了人 Hb之间及人Hb与各种动物 Hb之间的相互作用，发现人 Hb之间及人 Hb与羊膜类动物 Hb之间均存在相互作用，而与 非羊膜类动物Hb之间没有相互作用” 。 4．3 Hb与抗氧化酶的相互作用 Hb的自氧化作用是红细胞 内产生活性氧族 (Reactive Oxygen Species，ROS)的主要来源。 硫氧还蛋白过氧化物酶(peroxiredoxin 2，Prx2)是红细胞内的一 种重要的抗氧化蛋 白，是红细胞中除 Hb和碳酸酐酶外含量最 多的一种蛋白，具有清除 H：O：和过氧化物的功能。有研究指 出Prx2是与 Hb结合在一起存在的，并通过清除 H：O：或作为 伴侣蛋白来防止 Hb的氧化。其他研究也表明，Hb可以与 Prx2 之间发生相互作用 。 4．4 Hb与血影蛋白的相互作用 血影蛋白(spectrin)是红细胞 膜骨架的主要成份 ，约占膜提取蛋白的 30％，是一种纤维状蛋 白，由两条相似的 ot亚基和 B亚基构成。两个亚基反向平行，形 成异二聚体，两个异二聚体又聚合形成四聚体。lib与血影蛋白 结合形成复合体是红细胞衰老的一个重要标志，同时伴随着红 细胞胞质密度增大和红细胞的可变形性下降 。o／,珠蛋白能与 血影蛋白交联结合形成蛋白复合体，二者之间的亲和性要远远 高于完整的 Hb和 B珠蛋 白。红细胞内完好的 Hb结构能促进 血影蛋白从二聚体向四聚体的转变，当Hb的结构异常或被破坏 时，o／．珠蛋白就暴露出来与血影蛋白结合形成复合物，使红细胞 结构破坏。Mg“、ATP、2，3一DPG等能使 d珠蛋 白与血影蛋白 的亲和力下降，从而保护红细胞。H：O：等过氧化物能很大程度 地增加 仅珠蛋白对血影蛋白的亲和力，因而对红细胞产生毒害 作用。ATP能通过驱动磷脂移位，使得血影蛋白不被糖基化，从 而维护红细胞处于最佳状态，延长红细胞存活时间 。 4．5 Hb相互作用的生物信息学预测 随着蛋白质相互作用 数据的不断积累，各种蛋白质相互作用的数据库也在不断壮 大。面对高通量的错综复杂的蛋白质数据，从蛋白质相互作用 数据出发来模拟和分析蛋白质相互作用，成为蛋白质相互作用 研究的一种有效方法。王程等” 采用生物信息学方法对比脊 椎动物门各纲羊膜和非羊膜动物 Hb氨基酸序列的同源相似 性，推测脊椎动物 Hb相互作用发生的关键可能在于 ot链苏氨 酸(41位)与 8链组氨酸(98位)能否形成氢键。 5 Hb相互作用的研究中尚未解决的问题 近年来 ，随着蛋白质组学技术的不断发展和完善 ，科学家 们已经鉴定出上千种红细胞蛋白质，利用生物信息学技术，科 学家们预测和构建了红细胞 Hb相互作用的网络 J，这对深入 了解红细胞及 Hb的功能具有非常重要的意义。但在实验过程 中，如何去除高丰度蛋白如 Hb和碳酸酐酶等的干扰是一个亟 待解决的问题。另外由于红细胞没有细胞核 ，所以无法利用转 基因技术来进行体内相互作用的研究。因此 ，研究 Hb的相互 作用需要建立更加完善的体内实验方法。 参考文献 [1] Low TY，Scow TK，Chung MCM．Separation of human erythrocyte membrane associated proteins with one—。dimensional and two— di‘ mensional gel electrophoresis followed by 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