不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响

不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响 【摘 要】 目的 探讨不同脱钙液对牙齿牙周联合切片HE染色质量的影响。方法 选用 10%乙二胺四乙酸钠(EDTA)、复合酸(Plank-Rychlo脱钙液)和5%硝酸3种不同的脱钙液,分成 A、B、C 3组用于犬和大鼠牙齿牙周组织联合石蜡切片脱钙,通过脱钙时间,观察HE染色 效果,评价室温下(20?,28?)不同脱钙液对切片制作的影响。结果 A组脱钙液所制切片染 色效果良好,但脱钙速度缓慢,所需时间较长;B组脱钙液脱钙速度快,所制切片染色好;C组脱 钙液所制切片的染色强度和对比度均不如前两种脱钙液。结论 在制作牙齿牙周联合切片 时,EDTA脱钙液和Plank-Rychlo脱钙液所制切片均能取得良好的染色效果,但EDTA脱钙液脱 钙周期过长;Plank-Rychlo脱钙液脱钙均匀,速度快,更适合于临床速检工作;硝酸脱钙液组 染色效果较差。 【关键词】 脱钙;牙齿;牙周组织;石蜡切片;HE染色 【Abstract】Objective To investigate the effect of different decalcifying fluid on HE color of teeth and periodontal tissue united sections.Methods 10%EDTA decalcifying fluid, mixed acid(Plank-Rychlo)and 5% nitric acid were divided into three groups: group A, group B and Group C, which were used to decalcify the united paraffin sections of tooth and periodontal tissue from dogs and rats. The effect of three kinds of decalcifying fluid on manufacture of united sections was evaluated at room temperature(20?~28?)by decalcification time and HE staining quality.Results Group A had a good effect of HE staining, but its decalcification time was too long. Group B had either high speed decalcification or high staining quality.Group C was the last choice with the regard of poor staining intensity and contrast.ConclusionEDTA decalcifying fluid and Plank-Rychlo decalcifying fluid can get a favorable staining effect, but has a long decalcification period,Plank-Rychlo decalcifying fluid is more suited to clinical quick examination due to well-distributed and high speed decalcification. Nitric acid decalcifying fluid has a poor staining effect. 【Key words】 Decalcification;Tooth;Periodontal tissue;Paraffin section;Hematoxylin/eosin staining 在涉及口腔组织病理的研究中,需要制作牙齿牙周组织联合切片进行诊断、观察和对比分 析,但由于牙齿是全身硬度最高的组织,特别是牙釉质,其无机物成分羟基磷灰石 [Ca10(PO4)6(OH)2] 含量占97%,硬度与石英相似;牙本质、牙骨质及牙槽骨坚硬致密、易碎 难切,而牙髓、牙龈、牙周膜等软组织在切片过程中易受挤压、牵拉、分离变形甚至脱落。如 果硬组织不能很好地进行脱钙处理,很难制得优良的切片并获得满意的染色结果。为更好地了 解脱钙技术对牙齿牙周联合切片制作的影响,我们就室温条件下3种脱钙液的脱钙效果以及 对切片HE染色质量的影响进行了对比探讨。 1材料与方法 1.1主要仪器 SAKURA Tissue-Teb vip全自动脱水机(日本);Leica石蜡包埋机(德 国);Leica 2245轮转式石蜡切片机(德国)。 1.2脱钙液配制A液(EDTA脱钙液):EDTA 10 g,PBS缓冲液(pH 7.2)100 mL,加NaOH搅拌溶解后,用1 mol/L HCL调pH至7.2,再加甲醛15 mL[1]。B液(Plank-Rychlo脱钙液):氯化铝7 g,盐酸8.5 mL,甲酸5 mL,加蒸馏水至100 mL。C液(硝酸脱钙液):硝酸5 mL,甲醛10 mL,蒸馏水加至100 mL[2]。 1.3标本制备及分组标本为本院实验动物中心提供的大鼠和犬,大鼠、犬牙颌组织在取材前均用5%戊二醛-4%多聚甲醛内固定。大鼠开胸从右心房开口,经左心室行主动脉灌注,犬断头后从左右颈动脉灌注,之后将其浸入4%多聚甲醛固定液内固定24 h。固定好的标本用金刚砂外圆分割器进行修整,将犬牙颌组织沿唇舌向全层锯成大小约为1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm 的组织块。大鼠取完整的上下颌组织进行脱钙。每组脱钙液分别制作大鼠及犬牙颌组织标本各20例。 1.4脱钙及脱钙终点的判定采用上述3种不同脱钙液,在室温下进行脱钙,定期更换脱钙液,每间隔30 min探查脱钙程度,以标本肉眼观察至半透明状,手感有弹性,针灸针能轻松刺入,无砂粒感为脱钙完成,结合X-ray法确定脱钙终点。 1.5脱水和常规HE染色酸性脱钙液组脱钙完成后流水冲洗2,4 h,经除酸处理后入脱水机脱水,EDTA脱钙液组可直接入脱水机梯度酒精脱水,经透明,石蜡包埋,切片厚4 μm。行常规HE染色。 2结果 2.1脱钙时间A液脱钙所需时间明显长于其他两种脱钙液,约需8,10周,标本脱钙比较完全;而B液能使标本在5 d内达到完全脱钙的效果,所制切片均匀完整;C液是许多病理科用来处理骨标本的常用脱钙液,但由于牙齿硬脆难切等特性,用于牙齿脱钙却往往效果不佳,需时约1周以上且脱钙不均匀,切之有砂粒感。 2.2HE染色效果A液和B液脱钙充分均匀,无膨胀现象;切片完整,无划痕破碎情况。牙体组织(包括牙本质及其中的牙小管及牙骨质)结构清晰、完整。而且其中的牙髓组织、成牙本质细胞、牙髓细胞、骨和成骨细胞以及牙周组织中各种组织细胞结构均清晰,色质鲜艳,红蓝反差好,核染色质显示清楚。从层次上来看,很容易区分牙龈、牙周膜、牙髓、牙本质、牙骨质和牙槽骨等结构 (图1,2)。C液组切片颜色欠鲜艳,核不易着色,背景偏蓝,对比度较差,组织细胞结构欠清晰(图3)。 3讨论 对牙齿牙周组织进行组织学观察研究时,组织切片的制作是关键。但由于牙齿和骨组织都是钙化的硬组织,特别是牙釉质高度钙化,如果脱钙不彻底可导致切片破碎甚至无法切片,因此组织制片前选择合适的脱钙液就显得尤为重要。 EDTA是目前临床最常用的螯合脱钙剂,其脱钙机制主要是EDTA与羟基磷灰石结晶的外层钙结合,形成可溶性的非离子化合物,同时又促进晶体内层的结合钙向外转移,借助这种连续性的作用使羟基磷灰石晶体逐渐溶解,是最理想的制作HE染色和免疫组化染色的脱钙剂。但因其脱钙周期过长,EDTA脱钙技术很难满足临床活检病理诊断和鉴别诊断的需要,在临床病理诊断中应用很少,仅在研究中有一些。虽然也有许多研究报告微波或光波辅助能缩短EDTA对骨组织脱钙时间[3-5],但其程序繁琐且温度不易控制。也有研究报告低温下EDTA脱钙保存组织结构的完整性优于加热脱钙,不主张对其进行加热。我们研究认为室温条件下EDTA脱钙液对组织损伤小,HE染色效果好,但由于其脱钙时间过长,不适用于临床速检工作,更适合作为科研实验用脱钙液。复合酸类脱钙液是将两种或两种以上酸类脱钙液一起使用, 或在单纯酸内加入另一种脱钙液或少量的其他试剂所配制的脱钙液,这类脱钙液的特点是脱 钙完全、快速,可防止纤维组织过度膨胀,减少组织破坏及对染色的影响,还可以通过加入不同 的化学成分来弥补单纯酸类脱钙液的不足。脱钙液中三氯化铝的加入可降低溶液的pH值,进 一步加速脱钙,铝离子易被吸附而起到保护作用,又是苏木素等媒染助染剂,染色效果好,越来 越受到好评[3]。Plank-Rychlo脱钙液是一种温和、高效的脱钙液,标本经过充分的内、外固 定和良好的修整,使用该脱钙液进行切片HE染色效果与EDTA相似,而且脱钙时间大大缩短。 本研究结果明Plank-Rychlo脱钙液是一种适合用于口腔病理常规速检工作的脱钙液,可以 推广使用。硝酸脱钙液是多数病理科常用的骨脱钙液,用于制作牙齿牙周联合切片时,可使组 织结构发生溶解破坏和疏松。此外使用硝酸脱钙液时脱钙时间也不易掌握,常出现局部脱钙不 均匀的现象,脱钙时间过长组织细胞细微结构破坏严重,脱钙时间过短,脱钙又不彻底,不易制 作切片且损坏切片刀。硝酸在脱钙过程中可产生二氧化碳,气泡从组织中溢出时可造成脱钙后 结缔组织分离。用硝酸作脱钙液时硝酸易形成亚硝酸使脱钙液呈黄色,产生颜色后迅即影响脱 钙速度,且组织的黄染会妨碍随后的染色反应。在硝酸内加入1 g/L的尿素可以防止变黄而使 其无色,但尿素仅有暂时作用,一旦硝酸显淡黄色时需再加尿素(Clayden氏法)。硝酸在对组 织脱钙的同时也对组织酸化,因此HE染色容易造成细胞核着色欠佳。经本实验验证硝酸脱钙 液不太适用于牙齿及牙周组织脱钙。 可见,制作出优质的牙体牙周联合切片,选择合适的脱钙液是关键,此外还应注意以下几 点:?标本应充分固定,以便更好保护组织结构。?标本经过良好修整可提高脱钙质量,难以一 次成型的大标本可边脱钙边修整。?脱钙液的体积应不少于标本体积的20倍,为保证脱钙效 果,应经常更换脱钙液,以保持脱钙液浓度。?为获得最佳的染色效果,酸性脱钙液处理过的标 本脱钙完毕后应充分除酸。 参考文献 [1]Emans PJ,Bulstra SK,Kuijer R.The effects of differentdecalcification protocols on TUNEL and general cartilagestaining[J].Biotech Histochem,2005,80(3-4):111-115. [2]Fugaro JO,Nordahl I,Fugaro OJ,et al. Pulp reaction to vitalbleaching [J].Operative Dentistry,2004,29(4):363-368. [3]刘大维,初同伟,张良,等.微波脱钙骨的免疫组化染色[J].第三军医大学学 报,2003,25(1):77-78. [4]Tinling,Giberson,Kullar.Microwave exposure increases bonedemineralization rate independent of temperature[J].Microsc,2004,215(3):230-235. [5]Cunningham CD,Schulte BA,Bianchi LM,et al.Microwavedecalcification of human temporalbones[J].Laryngoscope,2001,111(2):278-282. (收稿日期:2009-05-08)