单纯过量醛固酮在正盐饮食下导致SD大鼠心肌受损.doc

单纯过量醛固酮在正盐饮食下导致SD大鼠心肌受损.doc 单纯过量醛固酮在正盐饮食下导致SD大 鼠心肌受损 作者:王川 张少玲 严励 程桦 【摘要】 【目的】 探讨单纯过量醛固酮在正盐饮食和正常血钾 情况下对SD大鼠心肌结构的影响及其可能机制。【方法】 正盐饮 食和补钾情况下，雄性SD大鼠随机分3组:对照组、醛固酮组和 醛固酮 + 安体舒通组，每组10只。观察4周，每周测量血压，实 验结束时观察心肌结构改变，比色法测定血清和心肌丙二醛(MDA) 水平和过氧化物歧化酶(SOD)活性，ELISA法测定血清超敏C反应 蛋白(hsCRP)水平，免疫组化法检测心肌ED-1表达，实时荧光PCR 法检测p47phox和p22phox 基因表达。【结果】 醛固酮作用4 周，SD大鼠血压轻微上升(P < 0.05)，但心肌超微结构已有改变; 同时，血清和心肌MDA水平和SOD活性、心肌p47phox基因表达 以及血清hsCRP水平均增加(P均 < 0.05)，但心脏局部未见炎症 细胞浸润。安体舒通可逆转醛固酮的影响，且不完全依赖血压的下 降。【结论】 单纯过量醛固酮在正盐饮食和正常血钾情况下可引起 SD大鼠心肌受损和氧化应激反应增强，这些变化先于心脏局部炎症 反应的出现。 【关键词】 醛固酮; 心脏; 氧化应激; 盐皮质激素受体 Abstract: 【Objective】 To investigate the direct cardiac injury of aldosterone alone in SD rats under normal salt diet and normokalemia and its possible mechanism. 【Methods】 Male SD rats receiving normal salt diet and potassium chloride supplementation for 4 weeks were divided into three groups (n = 10 in each group): control; aldosterone infusion; aldosterone infusion plus spironolactone. Systolic blood pressure (SBP) was measured every week. At the end of experiment， the myocardial structure was observed， malonaldehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity in serum and cardiac tissue were estimated by colorimetry， serum hsCRP concentration was assayed by ELISA， ED-1 expression of myocardium was analyzed by immunohistochemistry， p47phox and p22phox mRNA expression were measured using real-time RT-PCR. 【Results】 Aldosterone， under a normal salt diet and normokalemia， induced only a slight increase in the SBP of SD rats (P < 0.05). However， aldosterone significantly induced cardiac ultrastructure changes. Furthermore， aldosterone increased MDA formation and SOD activity in serum and heart tissue (P < 0.05)， increased the level of serum hsCRP and the expression of cardiac p47phox mRNA (P < 0.05). Simultaneously， no significant infiltration of monocyte/macrophage can be seen in the mesenchyme of myocardium. The effect of aldosterone was reversed by spironolactone， which was partly independent of SBP. 【Conclusion】 Excess aldosterone alone can induce cardiac damage and severe oxidative stress response before emergence of inflammation， even in the absence of salt loading and hypokalemia. 原发性醛固酮增多症目前被认为并不是一种少见病，它在高血压患者中所占比率远比以往认为的多，达到了10%甚至更高[1]。与同等血压的原发性高血压患者相比，原发性醛固酮增多症患者心脏损伤发生早、程度重，且这些损伤独立于血压升高[2]。但高醛固酮血症导致心脏损伤的具体机制尚不明确。既往动物实验显示过量醛固酮可通过氧化应激和炎症等途径导致心脏损伤[3，4]，但这些研究多是在合并高钠饮食(不小于10 g/L NaCl)、单侧肾切除或者二者结合的模型上进行的，并没有排除高钠饮食和单侧肾切除对心脏的作用。尽管后续Yoshida等在正盐饮食(5 g/L NaCl) (百分比浓度需要换算)以及保留双肾的情况下，发现醛固酮仍可导致SD大鼠心肌结构受损[5]，但该研究依然未排除醛固酮所致低血钾对心肌的影响。因此，过量醛固酮所介导的心脏损害是单纯醛固酮的作用，还是掺杂了高钠饮食、单侧肾切除以及低血钾的影响还不得而知。所以，有必要在排除这些混杂因素的情况下，研究单纯过量醛固酮是否对心肌产生损伤以及其可能机制。 1 与方法 1.1 动物与主要试剂 雄性SD大鼠30只，体质量180 , 200 g，由中山大学动物实验中心提供。醛固酮(Sigma公司)，安体舒通(杭州民生药业)，ED-1单克隆抗体(Millipore公司)，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，超敏C反应蛋白(hsCRP)检测试剂盒( 武汉中美生命科学技术公司)，Trizol(Invitrogen公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)，肾素活性检测试剂盒(DiaSorin公司)，醛固酮浓度检测试剂盒(DSL公司)，免疫组化试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，其余试剂为国产分析纯。 1.2 方 法 1.2.1 实验分组 SD大鼠随机分为3组，每组10只。所有大鼠均自由摄食(含5 g/L NaCl)。为防止醛固酮造成的低钾血症，自由饮用4 g/L氯化钾水。?正常对照组(CON):100 g/L水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后，把装有50 mL/L乙醇的微泵(2004型，美国Alzet公司)植入大鼠 颈后皮下组织。?醛固酮组(ALD):醛固酮溶解在50 mL/L的乙醇中，装入微泵植入大鼠颈后皮下组织，以0.75 μg/h的速度持续皮下输注。?醛固酮+安体舒通组(SPI):皮下输注醛固酮，同时予以安体舒通100 mg?kg-1?day-1灌胃。所有大鼠观察4周。 1.2.2 体质量和血压监测 实验开始以及此后每周测量体质量和血压。血压采用tail-cuff法测量清醒状态下收缩压(SBP)(BP-98A动物无创血压监测仪，Softron公司，日本)。 1.2.3 标本收集 实验结束前一天，大鼠被置于代谢笼中，饮食和饮水同前，分别收集24 h尿液，24 h摄食量、尿量，测定24 h尿钠、尿钾排出量。实验结束当日，100 g/L水合氯醛腹腔麻醉(0.4 mL/100 g)，腹主动脉穿刺取血，快速分离心脏，切取1 mm3大小的组织块放于戊二醛中固定，经锇酸二次固定，Epon树脂包埋，制成超薄切片，用饱和醋酸铀和10 g/L柠檬酸铅双染，透射电子显微镜(Philips CM10， Holland)观察心肌超微结构改变。心尖以上0.5 cm处水平切取厚约0.3 cm的心肌组织放于多聚甲醛中固定，制成石蜡切片，用于HE染色和免疫组化分析。余下心肌组织用液氮速冻后，放-80 ?保存用于蛋白和总RNA提取。 1.2.4 免疫组化法检测心肌ED-1表达 心肌组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，分别经胰酶抗原修复，30 mL/L过氧化氢避光孵育15 min，正常山羊血清室温封闭1 h，孵育抗ED-1抗体(1:50) 4 ?过夜，PBS冲洗后孵育辣根过氧化物酶标记的二抗工作液37 ? 1 h，DAB显色，显微镜下观察:阳性表达部分呈棕黄色，去离子水终止显色。然后依次苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片。设立阴性对照，一抗用PBS代替，其他步骤相同。 1.2.5 血清和心肌氧化应激指标的测定 MDA水平和SOD活性可反映氧化应激水平。MDA水平采用硫代巴比妥酸比色法测定，SOD活性采用化学比色法测定，操作按试剂盒说明书进行。 1.2.6 ELISA测定血清hsCRP浓度 血中hsCRP水平反映机体炎症反应程度。具体操作步骤见试剂盒说明书。每个样本均设复孔，分别建立标准对照和阴性对照。 1.2.7 实时荧光定量PCR测定心肌NADPH氧化酶亚基p47phox和p22phox mRNA的表达 用Trizol提取总RNA，检测总RNA纯度和浓度，然后进行反转录。按SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(DRR063S，TaKaRa，日 本)的操作说明进行，首先1 μg总RNA为模板，反应体积20 μL进行逆转录，反应条件为37 ? 15 min，85 ? 5 sec。再以RT产物为模板，用SYBR GREEN染料法进行Realtime PCR(LC480，罗氏)扩增目的片段，GAPDH作为内参照。引物(宝生物工程有限公司合成)序列如下:p47phox 5′-GGCAGGACCTGTCGGA GAAGGTGG-3′ (forward primer) 和5′-TGAAGGA TGATGGGGCCTGTGATG-3′(reverse primer);p22phox 5′-TGCGGGACGCTTCACGCAGTGG-3′(forward primer)和5′-GGTTGGTAGGTGGCTGCTTGATGG-3′(reverse primer);GAPDH 5′-GGCACAGTCAAGGC TGAGAATG-3′(forward primer)和 5′-ATGGTGGT GAAGACGCCAGTA-3′(reverse primer)。引物浓度10 μmol/L，反应体积20 μL，PCR采用两步法，第一步95 ?预变性10 sec，第二步95 ? 5 sec，60 ? 31 sec，共40个循环，用ΔΔCt法计算相对量。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。 1.3 统计学方法 数据均用均数 ? 标准差表示，应用SPSS 13.0进行统计学分析，组间对比采用单因素方差分析，显著性水平P < 0.05。2 结 果 2.1 基本实验指标的检测 醛固酮皮下输注4周，ALD和SPI组血清醛固酮水平高于CON组(P < 0.05，表1)，而血浆肾素活性低于CON组(P < 0.05)，说明低肾素性醛固酮增多症的大鼠模型造模成功。实验结束时，各组体质量差异无统计学意义(P > 0.05)，三组血钾均在正常范围内。实验第2周ALD组大鼠死亡1只，原因不明。 2.2 大鼠收缩压变化情况 三组基础收缩压差异无统计学意义(P > 0.05)。第1周开始ALD组收缩压升高至(127 ? 9) mmHg(P < 0.05)并维持到第4 W实验结束[(123 ? 7) mmHg，P < 0.05，图1];SPI组第2周收缩压升至(123 ? 13) mmHg后，呈逐渐下降趋势，至第4周下降至(116 ? 5) mmHg，此收缩压高于CON组(P < 0.05)，但低于ALD组(P < 0.05)。 2.3 心肌形态学改变 普通HE染色后，光镜下观察各组心肌组织均未见明显异常，无局灶性坏死，心肌细胞间以及血管周围未见明显炎症细胞浸润(图2)。 使用透射电镜观察心肌超微结构改变，ALD组部分心肌组织出现肌浆网扩张，线粒体肿胀、内部结构不清，肌丝、肌节结构模糊，H带和Z线不清(图3B)，而CON和SPI组心肌超微结构未见 明显异常(图3A、C)。同时，各组心肌细胞间未见明显炎症细胞浸润。 2.4 免疫组化检测心肌ED-1表达 ED-1是一种分子量为110 ku的糖蛋白，主要位于单核细胞/巨噬细胞的胞质内，因此该抗体用于检测组织内的单核细胞/巨噬细胞，可反映局部炎症反应的程度。免疫组化结果显示各组心肌组织间以及血管周围均未见明显棕黄色颗粒存在，即未见明显单核/巨噬细胞浸润(图3)，此与HE染色和电镜结果一致。 2.5 血清和心肌氧化应激产物的表达 醛固酮皮下输注4周，ALD组血清和心肌MDA水平分别是CON组的6.39和1.79倍(P < 0.05， 表2)，而血清和心肌SOD活性也分别增加了13.24%和24.88%(P < 0.05);SPI组血清和心肌MDA水平与CON组比较差异无统计学意义(P > 0.05，表2)。 2.6 血清hsCRP的变化 hsCRP是反应机体炎症反应程度的一个灵敏指标。ALD组血清hsCRP水平较CON组增加2.06倍[(9.60 ? 0.95) mg/L vs. (4.65 ? 0.69) mg/L，P < 0.05]，而SPI与CON组间差异无统计学意义(P > 0.05)。 2.7 实时荧光定量PCR检测心肌p47phox和p22phox mRNA表达 ALD组p47phox mRNA表达水平分别是CON和SPI组的2.56倍和1.65倍(P < 0.05，图5);SPI 与CON组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。三组间心肌p22phox mRNA表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)。 3 讨 论 3.1 单纯过量醛固酮短期作用便可导致心脏损伤 在正盐饮食和补钾的情况下，0.75 μg/h皮下输注醛固酮4周，SD大鼠血钾保持正常(4.10 ? 0.61) mol/L，血压轻微上升，但仍在正常范围内。此与既往动物实验0.75 μg/h醛固酮在高钠饮食(不小于10 g/L NaCl)和单侧肾切除下造成血压明显升高不同[5-6]。尽管本研究中血压仅有轻微上升但心肌超微结构已出现损伤，如线粒体肿胀、内部结构模糊等。这也提示我们应及早发现和消除高醛固酮血症，避免其对心脏的长期危害。 3.2 过量醛固酮导致氧化应激的增强早于心肌炎症的出现 线粒体与氧化应激反应关系密切，因此我们同时检测了醛固酮对氧化应激的影响。结果显示醛固酮可导致SD大鼠NADPH氧化酶亚基p47phox基因表达和MDA水平增加，同时SOD活性也代偿性增强。氧化应激的程度是活性氧族的产生和抗氧化防御平衡的 结果，本研究中抗氧化成分SOD活性尽管有增强，但幅度较小，不足以对抗活性氧族的增加，因此醛固酮促进了SD大鼠整体和心脏局部氧化应激反应的增强。 此外，本实验还观察到醛固酮引起血清hsCRP水平升高，但此时心肌组织间和血管周围并无明显炎症细胞浸润，这说明醛固酮可早期引起全身非特异性炎症反应，但不增强心脏局部的炎症反应。 因此，就本研究而言，单纯过量醛固酮在正盐饮食和正常血钾下作用4周，导致心脏局部氧化应激反应的增强早于局部炎症的出现。 氧化应激的过度增强可造成心肌损伤。体外实验显示醛固酮可激活大鼠血管平滑肌细胞和人单核细胞NADPH 氧化酶活性;而抗氧化剂可逆转醛固酮引起的心肌细胞肥大和氧化应激的增强[6]。此外，醛固酮合并高钠饮食可增加SD大鼠NADPH氧化酶活性从而导致心血管损伤[4]，而 NADPH氧化酶抑制剂可减轻醛固酮引起的这些改变[7]。因此，我们推测单纯过量醛固酮引起SD大鼠心肌的损伤可能由氧化应激所介导。这也提示在高醛固酮血症的患者中使用抗氧化剂或许可使心脏额外获益。 3.3 盐皮质激素受体拮抗剂对心脏的保护作用 本研究使用盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor， MR)拮抗剂-安体舒通阻止了醛固酮对心脏的损伤，但其作用不能单用血压下降来解释，因为实验结束时SPI组血压仍高于CON组[(116 ? 5) mmHg vs. (108 ? 6) mmHg，P < 0.05]。由于安体舒通同时减少了p47phox基因表达和MDA水平，推测安体舒通的心脏保护作用可能与其减轻氧化应激反应有关，这至少能部分解释其不依赖于血压下降的心脏保护作用。 长期以来安体舒通仅被当作保钾利尿剂来使用，但近年来发现其有独立于降压的心肾血管保护作用。MR拮抗剂可减少大鼠心梗后心肌纤维化，改善其心功能[8];高血压患者使用MR拮抗剂可提供额外的血管保护益处[9];MR拮抗剂可减轻糖尿病患者的肾脏损害，减少原发性高血压患者的微量白蛋白尿[10]，这些作用不依赖于血压的下降。鉴于MR拮抗剂有独特的心脏保护作用，2009年美国成人慢性心衰指南指出在中重度心衰患者中如无禁忌可加用MR拮抗剂改善患者预后[11]。 总之，在不合并高钠饮食、单侧肾切除以及低血钾的情况下，单纯过量醛固酮可导致氧化应激的增强和心肌结构受损。安体舒通可能通过抑制氧化应激反应逆转醛固酮对心脏的损伤。因此我们应及早发现和处理高醛固酮血症，避免其长期作用引起心脏损 害。同时，在使用MR拮抗剂的基础上加用抗氧化剂或许可增强心 脏的保护作用。 【