5997例母血胎儿游离DNA无创大规模平行测序筛查胎儿染色体数目异常

5997例母血胎儿游离DNA无创大规模平行测序筛查胎儿染色体数目异常 章 容～徐聚春～许欢欢～胡 斌～胡 华～姚 宏 (400038重庆，第三军医大学西南医院妇产科，产前诊断中 心) [摘要] 目的 对比观察母血胎儿游离DNA大规模平行测序(massively parallel sequencing ,MPS)无创筛查对常见染色 体数目异常的检测能力。方法 2011年6月至2012年11月在第三军医大学西南医院产前诊断中心共募集5997例孕妇参与本项 研究，年龄18,46岁，孕周12,36周。抽取孕妇静脉血5mL，分离胎儿游离DNA，常规Barcoding建库，Illumina GAIIx测序， 测序片段用基于二元假设的t检验和L-score。测序提示异常患者进行传统核型分析确认。结果 5997例患者，母血胎儿 游离DNA MPS提示染色体异常患者113例。提示异常的患者有89例做了核型对比分析， 21-三体符合率100%(28/28)，18-三 体符合率87.5%(7/8)，性染色体异常符合率33.3%(14/42)。传统唐氏综合征筛查对21-三体的漏检率为11.8%(2/17)，而MPS 方法无一漏检。年龄(P=0.261)和孕周(P=0.309)对MPS的异常检出率没有显著影响。结论 无创MPS检测对21-三体的筛查 的准确性和可信度高，优于传统唐氏综合征筛查方法，适用于21-三体胎儿的产前初筛，以降低羊水/脐血穿刺有创检测比例。 [关键词] 产前诊断;染色体病;核型;大规模平行测序 [中图法分类号] [文献标志码] A Non-invasive screening for chromosome abnormality in fetal free DNAs by massively parallel sequencing: report of 5 997 pregnant mothers Zhang Rong, Xu Juchun, Xu Huanhuan, Hu Bin, Hu Hua, Yao Hong (Center of Prenatal Diagnostics, Department of Gynecology and Obstetrics, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China) [Abstract] Objective To evaluate the detection rate of massively parallel sequencing (MPS)-based screening for chromosome abnormality of fetus free DNAs in their mother’s plasma, and provide clinical data for this non-invasive prenatal screening. Methods A total of 5 997 pregnant women with an age from 18 to 46 and a gestational age from 12 to 36 weeks who receiving prenatal examination in our center from June 2011 to November 2012 were recruited in this study. Five milliliters of peripheral blood were collected, and then the fetus DNAs were extracted from mother plasma and barcoded. The libraries of each sample were pooled and subjected to Illumina GA IIx analyzer. Short reads were analyzed by binary hypothesized t tests and L-score analysis. Positive results of MPS were validated by cordocentesis based karyaotyping. Results A total of 113 patients were found to be abnormal by MPS. Among them, 89 mothers accepted cordocentesis based karyaotyping, and the obtained sensitivity for trisomy 21 and trisomy 18 were 100% (28/28) and 87.5% (7/8), respectively. However, the sensitivity for sex chromosome abnormality was 33.3% (14/42). Routine screening for Down’s syndrome showed a false negative ratio of 11.8% (2/17), while MPS had no false ratio. The age (P=0.261) and gestational weeks (P=0.309) had no significant effects on the detection rates of MPS. Conclusion Non-invasive MPS screening is a more reliable detection for trisomy 21 than conventional routine screening for Down’s syndrome, and is suitable for large-scale screening for trisomy 21 to reduce the ratio of invasive cordocentesis based karyaotyping. [Key words] prenatal diagnosis; chromosome abnormality; karyaotype; massively parallel sequencing Corresponding author: Yao Hong, E-mail: yaohong6319@sina.com [通信作者] 姚 宏，E-mail: yaohong6319@sina.com [优先出版] 中国每年有1600万新生儿出生，出生缺陷率4%,此，需要发展高敏感性的产前无创染色体数目检测方 6%。染色体异常是导致出生缺陷的重要因素，在新生法。 [1-2][5]儿中的发生率约为0.6%。因此，染色体异常的筛发现妊娠妇女的血浆和血清中含1997年Lo等 查成为产前诊断的重要。目前，羊水/脐血穿刺-有游离的胎儿DNA，开辟了新的无创产前基因诊断技 核型分析是染色体异常检测的金，但其检测有一术领域。过去10年相继发展了多种基于母血中胎儿游 [6]定技术难度，且为有创操作，因羊水/脐血穿刺导致流离DNA的无创产前诊断检测。2008年兴起的大规模 [3]产的概率为0.5%,1%。传统基于生化指标和超声流平行测序(massively parallel sequencing, MPS)技术，[4][7-8]程的无创唐筛方法假阳性率太高，敏感性不够。因被证明可以有效检测21-三体。为进一步评估MPS 的对胎儿染色体数目异常的检测能力，我们与深圳华Oligonucleotide Kit(Illumina公司)Barcoding建库，然后经大合作开展了基于母血胎儿游离DNA进行MPS无创Illumina GAIIx测序。测序结果经比对、拼接、计算k-mer覆盖筛查的临床研究，迄今已经完成5997例孕妇的无创筛度，用基于二元假设的t检验和L-score判断某条染色体是否有 [8]查，并与传统唐筛和羊水/脐血穿刺-核型分析方法进。 拷贝数异常 行了比较。结果报告如下。 1.4 核型验证 1 资料与方法 无创产前MPS检测提示异常的孕妇，在知情同意原则下进 行核型分析验证。如孕周在18,24周，行羊膜腔穿剌术，抽取1.1 研究对象 羊水25mL;若孕周超过24周，进行脐血穿刺，抽取脐血2mL。2011年6月至2012年11月在第三军医大学西南医院妇产常规行羊水细胞或脐血培养，制片，G显带，计数核型不少于科进行孕期保健的孕妇，对其进行常规方法和无创MPS筛查30个分裂相，异常核型计数50个分裂相以上，分析3,5个核型。 方法的介绍，经过知情同意、自愿选择接受无创产前MPS基 1.5 统计学处理 因检测，共募集5997例。年龄18,46岁，孕12,36周，B 2超提示单胎、无地中海贫血基因携带者、孕前3个月无输血或 频数分布差异的比较采用x检验，定量指标差异的比较采骨髓移植记录。本研究严格遵守医学伦理学原则，获得了西南用t检验。统计学处理采用SPSS 13.0软件。 医院伦理委员会的批准。 2 结果 1.2 样本采集、分离 2.1 MPS检测结果 根据患者知情、自愿原则，行无创产前MPS检测前签署知接受无创产前MPS检测的孕妇的临床资料见表1。平均情同意;无菌抽取孕妇外周静脉血5mL，EDTA-K2抗凝，1 年龄30.4岁，平均孕周19(12,36)周，5997例孕妇中，有0×g 离心10 min，上清血浆分离后再次以16 000×g离心10 603349例做了传统的唐筛，2755例唐筛阳性(82.26%)。未做唐min。经此二步离心后的血浆冻存于,80?保存，干冰运送至筛的2648例中，包含1个或多个高危因素的孕妇有1619例深圳华大基因研究院进行后续MPS检测。 (61.14%)。无创产前MPS检测共提示113例染色体数目异常，1.3 MPS分析 其中21-三体36例、18-三体8例、13-三体2例、性染色体异 常52例(XXX、XXY、XYY等)、其他染色体异常15例。2 mL母体血浆采用QIAamp DSP DNA blood mini Kit(德国 Qiagen公司)提取分离胎儿游离DNA，采用Genomic DNA 其中89例同意做羊水/脐血穿刺-核型分析，确认异常核型52Library Preparation Kit和Multiplexing Sample Preparation 例(58.43%)，结果见表2。 表1 5997例无创产前MPS检测孕妇的临床资料[n(%)] 项目 年龄 18,24岁 835(13.92) 25,29岁 2001(33.37) 30,34岁 1411(23.53) 35,39岁 1584(26.41) ?40岁 166(2.77) 初产孕妇 4139(69.02) 孕周 12周 8(0.13) 13,16周 1014(16.91) 17,20周 3366(56.13) 21,24周 1082(18.04) 25,36周 527(8.79) 唐筛 阳性 2755(82.26) 阴性 594(17.74) 未做唐筛(包含1个或多个高危因素) 1619(61.14) 未做唐筛(无高危因素) 1029(38.86) 表2 MPS检测异常孕妇采用羊水/脐血穿刺核型分析验证的结果 染色体异常类型 MPS检测 核型验证 符合率(%) 错误 正确 21-三体 36 0 28 100 18-三体 8 1 7 87.5 13-三体 2 1 0 0 其他染色体 67 35 17 32.7 总计 113 37 52 58.4 2.2 MPS无创检测和传统唐筛的比较 年龄(岁) 18,24 819 16 1.92 我们进一步比较了传统唐筛和无创产前MPS检测的准确 25,29 1963 38 1.90 性，传统唐筛对21-三体的漏检率为11.8%(2/17)，而MPS30,34 1387 24 1.70 方法无一漏检。总共3349例孕妇做了唐筛，筛出阳性的孕妇35,39 1556 28 1.77 2755例，其中核型验证出15例21-三体、2例18-三体、敏感?40 159 7 4.22 a 孕周 性为0.62%。而无创产前MPS检测提示出36例21-三体、812 8 0 0 例18-三体、36例做核型验证，发现28例21-三体、7例18-13,16 996 18 1.78 三体、敏感性为97.2%。因此，和传统唐筛相比，MPS检测可17,20 3309 57 1.69 21,24 1060 22 2.03 减少96.2%的有创羊水/脐血穿刺操作，这对21-三体和18-三25,36 511 16 3.04 体胎儿产前诊断的无创化具有很强的实用价值。 a:P = 0.037，与其他年龄段比较 2.3 年龄和孕周对MPS检测的影响 2.4 羊水/脐血穿刺核型验证情况 由于MPS方法是基于分析母血胎儿游离DNA，其浓度变 从表2可以看出，MPS检测和经典核型检测对比分析结化对检测方法有重要影响。我们分析了年龄和孕周对MPS方果表明21-三体符合率100%(28/28)，18-三体符合率87.5%法的染色体异常检出率的影响，结果见表3。我们的结果表明， (7/8)，其他染色体异常符合率32.7%(17/52)。MPS方法检孕周范围在12,36周，MPS检测的异常率没有显著变化。而 测异常经羊水/脐血穿刺核型检测验证的异常核型结果见表4，年龄?40岁的孕妇，其妊娠胎儿的染色体异常率相比其他年 可见无创产前MPS检测对男性和女性胎儿的21-三体和18-三龄组显著升高(4.22%，P = 0.037)。 体异常均能有效检测。 表3 MPS方法对不同年龄和孕周孕妇血浆染色体异常检出率 项目 MPS检测结果(n) 异常率 (%) 正常 异常 表4 MPS方法检测异常的羊水/脐血穿刺-核型分析结果 MPS检测异常类型 n 羊水核型(n) 47，XY，+21(17) 21-三体 28 47，XX，+21(11) 47，XY，+18(1) 18-三体 8 47，XX，+18(6) 46，XX(1) 46，XX(1) 13-三体 2 46，XX(1) MPS检测可减少96.2%的有创羊水/脐血穿刺操作，对3 讨论 21-三体和18-三体胎儿产前诊断的无创化具有很强的染色体数目或结构异常所致的疾病称为染色体实用价值。目前分析策略的MPS对于13-三体和性染色病。染色体病是出生缺陷的常见病因之一，现发现人[9]采用非重复体数目异常的识别率尚不理想。Chen等类染色体数目异常和结构异常近万种，染色体病综合掩盖的人基因组参考序列提高测序短序列的比对匹[1]征100余个。以前只能通过核型分析才能发现胎儿是配数量，并校正GC含量偏倚，这种新分析策略使13-否患有某种染色体病，但其有创操作存在一定的流产三体识别率从36%提升到100%(25/25)，18-三体识别风险。传统基于血生化和超声的唐筛是无创方法，但率从73%提升到91.9%(34/37)。因此，分析技术的改对染色体数目异常检测的敏感度太低。现在无创产前进，将进一步提升对13-三体和其他染色体数目异常的MPS检测通过提取母血胎儿游离DNA，进行大规模平识别能力，拓展无创产前MPS技术的应用范围。 行测序，经序列的染色体覆盖度等生物学信息分析，理论上，在妊娠第30天左右就能在母血中检测到从而做出染色体异常风险程度判断。其判断结果对21-胎儿DNA。但是，胎儿游离DNA的浓度的变化范围较三体的准确性达到99%以上，可望替代不敏感的传统[10]大，对其检测存在失败的风险。Bianchi等采用MPS[7-8]唐筛方法。我们的大样本临床研究表明，MPS检测筛查了532例孕妇，有16例(3%)孕妇血浆未能提取对21-三体和18-三体具有很高的敏感性，非常适用于出足量的胎儿DNA导致检测失败，96例唐氏综合征胎对21-三体和18-三体胎儿的初筛。和传统唐筛相比， 儿中有4例(4.2%)MPS检测结果为无法判断，426例查能力，扩大应用范围。因此，后续应进一步开展大正常胎儿中有24例(5.6%)MPS检测结果为无法判断。样本、前瞻性的临床研究，同时比较MPS无创筛查、游离胎儿DNA的浓度受多种因素的影响，如先兆子传统唐筛、羊水/脐血穿刺-核型分析三种方法的灵敏 [11]痫、妊娠呕吐、早产、非整倍体胎儿。怀有21-三度、特异性，从而对MPS无创筛查方法的准确性做出体胎儿的孕妇血浆中胎儿DNA浓度明显升高，但18-完整的评估(假阴性率、假阳性率等)。同时，发展三体胎儿的孕妇并不出现这种现象，这可能是18-三体新的算法和分析策略，拓展对13-三体、其他三体、性胎儿的MPS检测符合率低于21-三体胎儿的原因。我们染色体等数目异常的筛查能力，扩大MPS无创筛查方的研究均在孕12周后采血，避免了孕早期胎儿DNA含法的应用范围。 量不足的因素。而且，12,36周的MPS检测的异常比参考文献: 例大致相等，维持在1.7%,3.0%水平，说明我们开展1. 吴清明, 周瑾. 出生缺陷产前筛查及产前诊断研究进展[J]. 中国优生与遗传杂志, 2011, 19(1):129-131. 的无创MPS检测的采血时间是适合的。 2. Ministry of Health, People’s Republic of China. Report on Women and 由于欧美等国MPS检测的费用在765,2762美元Children’s Health Development in China[M]. Beijing: Ministry of Health, 2011. 不等，还是比较昂贵，同时检测实验室具备高水3. Liao C, Wei J, Li Q, et al. Efficacy and safety of cordocentesis for [12]平的分析技术。从卫生经济角度考虑，Wald提出在prenatal diagnosis[J]. Int J Gynecol Obstet, 2006, 93(1): 13-17. 4. Ghaffari S R, Tahmasebpour A R, Jamal A, et al. First-trimester screening 孕早期可以先用传统方法组合，如超声、游离βfor chromosomal abnormalities by integrated application of nuchal -hCG、PAPP-A和年龄因素评估，确定高危风险的孕translucency, nasal bone, tricuspid regurgitation and ductus venosus flow combined with maternal serum free beta-hCG and PAPP-A: a 5-year 妇进一步做MPS检测。低风险的孕妇在孕中期再次采prospective study[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2012, 39(5):528-534. 用超声、游离β-hCG、PAPP-A、AFP、uE3、inhibin-A5. Lo Y M, Corbetta N, Chamberlain P F, et a1. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997, 350(9076): 485-487. 和年龄等指标重新评估，高风险的孕妇直接行羊水穿6. 郭奇伟, 周裕林.利用母血胎儿游离DNA进行单基因病无创产前诊断研究进展[J]. 中华医学遗传学杂志, 2009, 26(4):410-413. 刺/核型分析。随着MPS技术的快速发展，其成本也在7. Chiu R W, Chan K C, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of 不断下降。同时，将来MPS数据的生物信息学分析服fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 务将更加普及，因此MPS检测的费用将会逐步下降，105(51):20458-20463. MPS产前检测为非侵必然成为常规筛查。总之，无创8. Dan S, Wang W, Ren J, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 入性检测，对孕妇和胎儿都是安全的，并且在妊娠早and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors[J]. Prenat Diagn, 期就可以开展，具有很高的敏感性和准确性。随着二2012, 32(13): 1225-1232. 9. Chen E Z, Chiu R W, Sun H, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of 代测序技术的快速进步和费用的快速下降，无创MPSfetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing[J]. 产前检测胎儿游离DNA将成为所有孕妇围产保健的PLoS One, 2011, 6(7):e21791. 10. Bianchi D W, Platt L D, Goldberg J D, et al. Genome-wide fetal 常规步骤，为降低出生缺陷做出重要贡献。 aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J]. Obstet Gynecol, 2012, 119(5): 890-901. 本研究为回顾性总结分析，不足之处在于:(1)11. 杨波, 吕运来, 马红丽, 等. 孕妇外周血中胎儿游离DNA的研究进展经典核型检测验证的孕妇仅36例，19.6%的MPS异常[J]. 中国输血杂志, 2011, 24(10):910-913. 12. Wald N J, Bestwick J P. Incorporating DNA sequencing into current 孕妇未进一步做核型验证，可能导致符合率的高估;prenatal screening practice for Down’s syndrome[J]. PLoS One, 2013, (2)没有对大样本的孕妇同时开展MPS无创筛查、8(3): e58732. (收稿:2013-05-24;修回:2013-06-18) 传统唐筛、羊水/脐血穿刺-核型分析3种方法之间的比 ,编辑 王 红, 较，缺乏假阴性率的评价;(3)需要改进分析方法， 拓展对13-三体、其他三体、性染色体等数目异常的筛