钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究

钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究 农业环境科学学报 ,::8,,7(6):2447-2451 ::,,,,, :,,,,: -,,,,,:,,,,, ,,,,,,, 钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究 11211张艳红 ，肖艳琴 ，李翠兰 ，张秋华 ，段毅豪 (1.山西大学环境与资源学院，山西太原 030006;2.山西大学生命科学与技术学院，山西太原 030006) 摘 要:钩虾的 Idh-1、Idh-2、Pgm、Pgi Ao-1 和 Ao-2 基因座位具有多态性，从平均每个基因座位的等位基因数A(=2.6:2.9)、多态 基因座位百分率(P=71.4%)、平均观察杂合度(H=0.226:0.246)和平均期望杂合度(H= 0.394:0.409)4 个参数可知，钩虾具有较高 o e 的遗传多样性，适合于农药马拉硫磷作为选择因子用于对具有不同基因型的个体的致死性差异研究。本实验以钩虾为对象，通过-6-1 急 性毒性实验方法，研究了钩虾等位酶基因型与马拉硫磷急性致死作用的关系。结果表明，供试钩虾1用0g L马拉硫磷溶液?处理 382 只，96 h 后死亡率为 68.8,。分别对存活个体和死亡个体的Idh -1、Idh-2、Pgm、Pgi Ao-1 和 Ao-2 基因座位进行等位酶分析以确 2 定每个个体的基因型。列联表 χ检验表明:马拉硫磷对Idh -1、Idh-2、Pgm 和 Ao-2 各基因型个体的选择呈现随机特征，各基因型与 死亡率未见显著的相关 (P>0.05)。但在 Gpi 和 Ao-1 基因座位上，Pg-iAC 和 Pg-iAD 基因型死亡率间存在显著差异A;o-1-AC 和 Ao-1-BB、Ao-1-CC 基因型死亡率之间存在显著差异。显示马拉硫磷的致死作用对Pgi 和 Ao-1 基因座位的不同基因型呈现出非随 机特征，Pgi-AD 和 Ao-1-AC 基因型很可能与钩虾对马拉硫磷的耐药性有关。 关键词:钩虾;马拉硫磷;基因型;等位酶;死亡率差异 中图分类号:X830.2 文献标识码:A 文章编号:1672- 2043(2008)06- 244705- Lethal Responses Among Allozym e Genotypes of Gammarus pulexto Acute Exposureto Malathion 11211ZHANG Yna-hong, XIAO Yan-qing, LI Cuian, ZHANG Qiu-hu,a DUANY ihao -l- (1.College of Environmental Sciences and ResourceShs, anxi University, Taiyuan 030006, China; 2.Cllegeo of Life Science and Technloogy, Shanxi University, Taiyuan 030006, Chian) Abstact:A population of Amphipods Gammarus pulex from YuanpShinganx i CPritoy,v incein China were foundl ypmoorphic at thel oci of r Idh-1, Idh-2, Pgm, Pgi, Ao-1 andA o-2, using horizontal starchg el electrophorseis. The data of the mean numbaellre loefs perl ocus (A = 2.6~2.)9, percentage ofl ypmoorphic loci (P = 71.4%), the observed mean hezytegrosoity (H= 0.226~0.24)a6nd the expected meatn) h eo erozygosity(H= 0.394~0.40)sugg9est thatht is populationp ossessessuff icient genetic diversity, which makeits feasible for studying the pos ) e sible differential mortality among theind ividuals of various genotypesc utaely exposed to amlathion, the pesticide commonly foundin agricul ) 61 --tural runoff.A total of 382 G. pulexind ividuals were exposedm toala thion at 10g?Lto achievem ao rtality of 68.8% after 96 hours llowfoed 2by allozyme analysis to identify the genotypes of eacindhi vidual. Contingency tabχle-t ests showed that amlathion displayed randolmeth al effects among the genotypIdesh a-1,t Idh-2, Pgm, Pgi andAo -2, where noo crrelation between the genotype laendtha lity was observ(edP > 0.05). Howevesr,ign ificant differential mortalities were observiend the following genotype pirsa :PgiAC (93%)vs. PgiAD (25%), Ao-1--- AC(37%)vs. Ao-1-BB(69%), andA o-1-AC(37%)vs. Ao-1-CC(72%). Since the sampsileze of Pg-iAC(27)and Pg-iAD(8)may not be sufficiently large furthere xamination is needed.At thel oci of Ao-1, under the assumptions) othef 1 presence of unifobrmiolo gical characters other than Ao-1 genotypes, and)the 2 presence aollf elic interaction and heterzoygotic vigor for theall eles of Ao-1-A and Ao-1-C, it is ex) pected thaAt o-1-AC wouldd isplay lower mortality thanA o-1-CC when exposed toa lmathion. The dataobt ained from the study weforeund consistent with such reasoning, which suggestscorr thelaatt iothen o f Ao-1-AC genotype to thes irsetance to pesticide malathion in G. pulex. The dataim ply that monitoring the dyincsa mof Ao-1-AC genotypes and perhaApso- 1-A allele frequency may be useinful e valuating the resistance potential of this populationa gainst malathion exposure. Keywords:Gammarus pulexm; alathion; genotypea;ll ozyme; differential mortality 收稿日期:2008-01-07 基金项目:山西省基础研究项目(200601101)5;国家自然科学基金资助项目(2017701)2 作者简介:张艳红(1980—)，女，硕士研究生，研究方向为环境毒理学。 通讯作者:段毅豪 E-mail:duany@sxu.edu.cn 近 20 年来，害虫防治采用高浓度、大剂量的杀虫 钩虾(Gammaruspule x)属于端足目钩虾科(Gam, 剂，严重地污染了包括水生系统在内的生态环境，威 maridae)，甲壳纲动物。供试钩虾采自山西原平云中胁到人畜及害虫天敌的安全。大量复杂的微量有毒有 河，运回实验室后，在去氯的自来水中饲养，隔一天饲 害的化合物如环境激素排入水生系统也对水生系统 喂不含色素的金鱼饵料(fish flake)一次。供试虫体用 -6-1 和人类的健康产生了更为严重的危害。监测和评价水 10g?L马拉硫磷溶液处理，96 h 后对活体和死亡个 生生态状况及控制污染物排放是当前面临的挑战之 体分别计数，并计算其死亡率，判断死亡的为用 一。多种生物测试方法如具有很高的生态相关性的单 镊子轻触虫体，肢体不再运动的即为死亡。虫体单独 物种毒性试验、微宇宙实验等已广泛应用于评价和预 分别包装，冻存于-80 ?冰箱待用。 测有毒有害化合物对水生系统的影响，但是这些方法 1.3 等位酶电泳 敏感性较低，无法对环境状况的发展以及生物在遗传 根据以前研究结果，对有多态性的异柠檬酸脱氢 水平发展方向作出指导。 酶(IDH)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、磷酸葡萄糖变位 酶(PGM)和苯甲醛脱氢酶(AO)进行淀粉凝胶电泳。 应用环境生物酯酶等位酶谱带可以作为对有害 有毒物质的检测方法。Maa 等发现小菜蛾(Plutella 凝胶浓度为 12.5%，采用 Tris- 柠檬酸缓冲液(0.05 [1]1-xylostella)对马拉硫磷的抗性与酯酶等位酶有关。李 molL，pH8.0)，电极缓冲液与凝胶缓冲液比例 9?1，? 暄等对抗阿维菌灭小菜蛾酯酶等位酶的研究中发现 凝胶大小为 234 mm×135 mm×18 mm。 在杀虫药剂逐代选择过程中，其酯酶基因型正从杂合 取钩虾个体置于 25 μL 双蒸水内冰浴匀浆，浸入 3 mm×9 mm滤纸芯作为上样样品 。上样后在4 ?冰箱 [ 2 ] 型向纯合型过渡。 乔传令等的研究表明小菜蛾 -1内恒压(10 Vcm)电泳 4.5 h，水平切片后用特异性 ?(Plutella xylostella) 对阿维菌素杀虫剂的抗性与酯酶 [7]染色方法进行染色。酶谱判读时，同一基因座位泳动 [3]基因型的变异有关。但酯酶谱带复杂，难以判读。故 最快的带记为 A，以后依次记为 B、C 等。 需要开发其他稳定的等位酶标记用于种群遗传水平 1.4 数据处理的监测和评估。但有关这方面的研究尚不多见。有研 1.4.1 基因型与死亡率之间的相关性检验究表明美洲钩虾(Hyalella aztec)a种群的遗传结构与 对钩虾多态基因座位的各基因型与死亡率进行[4]2 重金属抗性比率呈现明显的相关性。李翠兰等发现 2×2 列连表 χ检验，以了解基因型与马拉硫磷致死作 用之间的相关性。在进行统计分析时，各多态基因座 中华稻蝗 Gpi 基因型与有机磷农药敌百虫和阿维菌 [5-6]位上的每个基因型为一组，每组的个数即为重复。 素的急性致死作用存在显著相关性。 1.4.2 种群遗传结构分析 马拉硫磷是一种非内吸性低毒类有机磷杀虫剂， [8]应用 BIOSYS-?软件计算存活组、死亡组及初 全名为 O，O二甲基S(1，2二乙氧羰基乙基)二硫 ----始种群各基因座上的等位基因频率，对哈-温(，-,) 代磷酸酯。钩虾(Gammarus pulex)是水生生态系统中 的重要类群，在水生态系统能量传递和物质循环中起 重要作用，对于污染物具有较高的敏感性，已被广泛 平衡的符合度，固定指数(F)，每个基因座的多态性、 地运用于毒理学试验。 杂合度(H)和 Rogers 遗传距’ 离。 本实验以钩虾为研究对象，利用钩虾种群遗传结 构特点，通过了解钩虾等位酶基因型与马拉硫磷急性 2 结果 致死作用的关系，探索将这种关系作为钩虾对马拉硫 2.1 钩虾种群遗传结构分析 马拉硫磷急性毒性处理磷的生物标记物(biomarker)的可能性，从而为环境监 后钩虾存活组、死亡组和 测方法构建模式生物提供科学依据。 初始样本的等位基因频率、哈 温(H W)平衡适合 --1 材料和方法 度、每个基因座位的杂合度(H)和固定指数(F)见表 1.1 供试农药 1。结果表明，钩虾种群的Pg m2 为单态基因座位- (0.95 标准)，而 Idh 1、Idh 2、Pgi、Pgm 1、Ao 1 和 ----马拉硫磷(Malathion)是一种非内吸性低毒类有 Ao2 为多态基因座位。Ao1 有 2 个等位基因，Idh1 ---机磷杀虫剂。本实验所用马拉硫磷原药(45%乳液)购 和 Ao2 有 3 个等位基因，Idh2、Pgi 和 Pgm1 有 4 ---自山东省德州市。 个等位基因。Pgi 的基因型频率符合哈温平衡预期 -1.2 样本采集及处理 值，但 Idh1、Idh2、Pgm1、Ao1 和 Ao2 显著偏离 ----- 第 ,7 卷第 6 期 农 业 环 境科 学 学 报2449 哈温平衡预期值(表 1)。其中 dh1、Ao1 和 Ao2 -I---均观察杂合度(H= 0.226:0.24)6和平均期望杂合度 o 是由于杂合体缺乏(F>0) 马拉硫磷处理后钩虾存活(H= 0.394:0.40)9，适合于马拉硫磷等农药作为选择 e 组、死亡组和初始样本 因子用于对具有不同基因型的个体的致死性差异研 究。H小于 H，表明钩虾种群出现了一定程度杂合体 在 7 个基因座位上的种群遗传度量值见表 2。由表 2 o e 可知，钩虾种群在 6 个基因座位上的多态性程度较 缺乏现象，这可能是由于非随机交配等因素引起的， 高，体现在较高的平均每个基因座位的等位基因数 也可能存在不利于某些杂合体的自然选择。 2. 2 钩虾多态基因座位的各基因型与马拉硫磷致死 (A = 2.6:2.9)、多态基因座位百分率(P = 71.4%)、平 表 1 马拉硫磷处理后钩虾 3 个样本在 Gpi、Ldh、Ao 和 Pgm基因座位的等位基因频率 、基因型频率对哈-温平衡预期值的 卡方检验、每个基因座位的杂合度(H)和固定指数(F) Table1 Allele frequency, Chi-square testsHardy for- Weinbergs expectation of genotype frequency, heterozygosit(H)y’ and fixation inde(F)xper loci at seven lociin alive,dead andinitial samples of Gammarus pulex acutely exposed to malathion 2 基因座位 Locus 样本量(N)Sample(N) A B C D H F χ a存活组 Alive 0.188 121.766** 0.582 (101)0.569 0.243 0.745 Idh-1 死亡组 Dead 初(225) 0.262 169.632** 0.599 0.542 0.196 0.622 始样本 Initial 存(326) 0.239 284.283** 0.595 0.551 0.210 0.660 活组 Alive 死亡(119) 316.017** 1.000 0.034 0.066 0.008 0.706 0.252 Idh-2 组 Dead 初始样(263) 0.051 0.011 0.236 0.000 0.702 本 Initial 存活组 (382) 0.046 0.010 0.241 956.006** 0.022 0.703 1.000 Alive 死亡组 (119) Dead 初始样本 (263) 0.034 0.008 0.252 16.173 0.437 0.706 0.192 Pgi Initial 存活组 (382) 0.051 0.011 0.702 0.236 9.687 0.450 -0.091 Alive 死亡组 (93) 0.046 0.010 0.703 0.241 4.561 0.446 -0.004 Dead 初始样本 (68) 0.091 0.253 0.398 0.258 29.798** 0.703 -0.010 Pgm-1 Initial 存活组 (144) 0.118 0.228 0.478 0.176 73.490** 0.675 0.150 Alive 死亡组 (98) Dead 初始样本 0.160 0.115 0.271 0.455 0.681 104.920** 0.011 (92) Initial 存活组 1.000 0.000 Pgm-2 (190) Alive 死亡组 (111) 0.000 1.000 Dead 初始样本 (80) 1.000 0.000 Initial 存活组 (191) 0.180 0.295 87.566** 0.878 0.820 Ao-1 Alive 死亡组 (125) Dead 初始样本 0.400 0.600 81.099** 0.480 1.000 (218) Initial 0.272 0.396 0.728 172.774** 0.947 (351) 0.300 0.664 0.372 42.504** 0.289 0.328 Ao-2 0.266 0.648 0.443 0.291 133.851** 0.554 0.295 0.658 0.407 0.298 164.228** 0.472 2 注:a 为括号内的值为样本数目χ;为基因型频率对哈温平衡预测值的卡方检验值(P<0.01);H 为杂合度的直接观察值。 -**2a:Samplesi ze in parenthesis;χ:Chisquare values of HW expectations of genotypefre quencie(sP<0.05;P<0.01);H:Direct count of hteerozygosity. --*** 表 2 马拉硫磷处理后钩虾 3 个样本的遗传多样性 Table2 Genetic variabilityat the seven lociin alive，dead andinitial samples of Gammarus pulex acutely exposed to malathion 平均杂合度 Mean heterozygosity 样本每个基因座位平均样本大小 平均每个基因座位等位基因数多态基因座位百分率 直接观察值温平衡预期值 哈-Samples Mean no. ofll eales per locu(sA) Percentage lofoc i polymorphic*(P) Means ample size per locus direct-coun(t H) Hdywbge xpected**(H) oe存活组 Alive 109.(44.6) 2.9(0.4) 0.24(60.104) 0.39(40.107) 71.4 死亡组 Dead 169.(632.2) 2.6(0.5) 0.22(60.091) 0.40(90.110) 71.4 初始样本 Initial 277.(637.3) 2.9(0.4) 0.24(20.098) 0.40(10.108) 71.4 注:* 当最常见的等位基因频率小于 95%时，即为多态基因座位**; 无偏差估计(Nei, 1978);括号内的值为标准误差。 *A locus is considered polymorphic if the most commoallne le does not exceed 0.(9s5ta ndard erroinrs p arenthesis); Unbiasede stimate (seeN ei, **197)8;Standard erroinrs p arenthesis. 表 3 钩虾 6 个基因座位各基因型对马拉硫磷致死率的影响 Table3 Genotype effects on the probability of death for six polymorphicin Gammarus loci pulex exposed to malathion 等位酶基因型 Allozyme genotype AA AB AC AD BB BC BD CC CD DD 0.74 0.68 1.00 0.67 0.74 0.56 Observed Idh-1 个 (46/62) (13/19) (13/13) (103/153) (25/34) (25/45) 多 态 0.00 0.68 0.00 Idh-2 基 (0/2) (241/355) (0/2) pp因 orol座 yb0.93a 0.25b 0.75ab 0.65ab 0.54ab 0.75ab moa位 Pgi b(25/27) (2/8)** (6/8) (121/18)7 (96/128) (13/24) ilir各 pht基 yi c1.00 1.00 0.24 0.33 0.00 0.28 0.50 0.31 0.61 0.25 of death for 因 Pgm-1 lo型 (4/4) (2/2) (4/17)** (2/6)** (0/2)** (9/32) (20/40) (25/41) (2/8)** (4/13)** ci的 死 0.62ab 0.67ab 0.69b 0.72b 0.37a 0.61ab Ao-1 亡 (39/63) (18/27) (20/54) (75/109) (25/41) (41/57) 率 six0.64 0.00 0.35 Ao-2 (32/50) (0/4) (48/137) 6 注:括号内的值为样本大小*;* 观察值小于 5，不进行统计分析;标有不同字母的死亡率之间有显著差异，a如 和 b 之间有显著差异(P<0.05)。 *Samples ize in parenthesis. Thepr obabilities of death among genotypessh anriongt the samlee tter are significantly different. For example, ab iv.s.s significantly differen(t P<0.05). 拉硫磷对 Idh-1、Idh-2、Pgm-1 和 Ao-2 4 个多态基因 作用的关系 用马拉硫磷处理钩虾成虫共 382，平均死亡率为 座位各基因型个体的致死作用呈现随机性特征，但对 68.8,。, 个多态基因座位上各基因型个体的死亡率 Pgi 和 Ao-1 基因座位各基因型的致死作用却呈现非 2 及各基因型与死亡率的 ,×列联, 表 χ检验结果见表 随机效应，在 Pgi 基因座位上，具有 Pgi-AC 基因型个 2 ,。χ检验结果表明，Pgi-ac 和 Pgi-ad 基因型死亡率 体的死亡率(93%)显著高于具有 Pgi-AD 基因型个体 间存在显著差异;Ao-1-ac 和 Ao -1 -bb、Ao -1 -cc 基 的死亡率(25%，P<0.05，表 3)。 考虑到这两个基因 因型死亡率之间存在显著差异。 型的个体数量不是太大(分别为 27 和 8 个)，需要进 一步增加样本量进行确认。本研究同时发现，在A o-1 , 讨论 基因座位上，具有A o-1-AC 基因型个体的死亡率 农药面源污染在一定程度上改变了自然地理环 (37%) 显著低于具有 Ao-1-BB 的死亡率 (69%)和境，使得生物种群面临一个受胁迫环境。污染胁迫最 Ao-1-CC 基因型个体的死亡率72(%，P<0.05，表 3)。 显著的效应就是污染物使敏感个体逐渐减少或消失， [4]进一步分析，假设?除A o-1 基因型外，本钩虾种群 因而改变了生物种群的遗传结构。利用水生生物种 群遗传结构动态变化作为水环境污染的监测指标是 的其他生物学性状相同;?Ao-1-A 和 Ao-1-C 等为 反映水环境污染程度的一条新的思路。以无脊椎动物 基因存在相互作用，并表现杂种优势，则具有A o-1- 和鱼类为实验动物的研究表明，环境污染物作为环境 AC 基因型的个体死亡率应该显著低于 Ao1CC 基 --选择因子与等位酶基因型频率的改变有显著的相关 因型的死亡率。以上推论与本研究数据相吻合，表明 [4，911]-关系。本文使用急性暴露浓度处于以下考虑:? 本钩虾种群中，Ao-1-AC 基因型很可能与钩虾对马 动物对 LD附近的剂量反应变化较为敏感;?急性 50 拉硫磷的抗性有关。当然，这种相关关系不能等同为 暴露结果往往可以给长期暴露结果提供研究线索。 因果关系。等位酶基因型的动态有可能成为潜在的环 本实验结果表明:(1)原平钩虾种群在4 种等位 [9-11]境因子标记，进一步工作应该结合其他遗传标记 酶(IDH、PGI、PGM、AO)上具有很高的多态性(表 2)， 结果和种群生态特征，探讨种群遗传结构和抗性进化 且 6 个多态基因型座位 (Idh-1、Idh-2、Pgi、Pgm-1、 之间的关系。 Ao-1 和 Ao-2)的稳定性高、活性强，酶谱分辨率高， 使其成为研究酶多态性与环境因子关系的理想生物 参考文献: 物种。(2)本钩虾种群的 6 个多态基因型座位(Idh-1、 [1] MaaW C, Liao S C.C ulture -dependnte variation in esteraseis ozymes Idh-2、Pgi、Pgm-1、Ao-1 和 Ao-2)上的基因型对马拉 and malathion susceptibility of Diamondback moPtlhut,e lla xylostella 硫磷的致死作用具有不同响应(respons)e，表现为马 L[J]. 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