【doc】肝非实质细胞在内毒素所致肝细胞损害中的作用

【doc】肝非实质细胞在内毒素所致肝细胞损害中的作用 肝非实质细胞在内毒素所致肝细胞损害中 的作用 2]一弱 中华消化杂志1994年lOB第H卷第5期 肝非实质细胞在内毒素所致肝细胞损害中的作用 王宇明大西弘生武藤泰敏刘沛,J7,一, 一一 K 摘要对小鼠体外肝细胞进行了内毒素(1ipopolysaccharide,LPS)直接毒性作用的研究.发现 LPS对肝细胞有明显损害作用,现为肝细胞变性坏死,存活率降低培养上清谷草转氨酶fAST) 增高,上述改变程度与LPS)~IX量成正比.肝细胞单独培养组与肝细胞.肝非实质细胞混合培养组相 比,各指标差异无显着性(P>O.05).然而.经D一氨基半乳糖及LPS体内预处理导致肝损伤后分离 肝非实质细胞,以其取代正常的肝非实质细胞,此时肝非实质细胞的存在不仅加重LPS所致的肝细 胞损害,且对正常肝细胞也有轻度损伤作用,提示被激话的肝非实质细胞可加重LPS所致的肝细 胞损害. 关键iE内毒素培养肝细胞培养旰非实质细胞细胞毒性作用小鼠 ——一————一r——————一一r—, 肝脏作为内毒素血症的重要靶器官之一 近年来受到广泛重视.由于受到体内多种因素 的影响,有关内毒素(Iipopolysaccaride. LPS)所致肝细胞损害的确切机制不易阐明.一 般认为,在LPS所致的肝细胞损害中.肝非实质 细胞(主要是Kupffer细胞)起着重要的作用.为 此.我们对小鼠体外肝细胞和肝非实质细胞进 行了有关LPS毒性作用的研究. 材料与方法 一 ,肝细胞分离及培养方法 取6,7周龄的Balb/c雄性小鼠(日本静冈 中部科学会社提供),按胶原酶灌流法稍加改良 分离肝细胞,以50g反复离心获取肝细胞,以 50g及500g交替反复离心获取肝非实质细 胞.经台盼蓝染色,存活率分别在85和95以 上者用于实验.取肝细胞2×10个/ml,肝非实质 细胞2×10e个/m1接种于经胶原被覆的培养皿 (孔径22ram),WilliamE培养液中含5小牛血 清,胰岛紊及地塞米松各1×10一. mol/L.二氧化碳培养箱条件为37.C5%CO 3o0湿度100培养程序为:肝细胞接种2 小时后去除上清,继加肝非实质细胞,再经2/5 时后去除上清,改为无血清培养(WilliamE培 养液中含胰岛素和地塞米松各lx10-~mol/L), 201],时后实验开始.另设一组,其肝非实质细胞 取自肝功能不全的小鼠.即先以D.氨基半乳 糖(GAIN),800mg/kg体重及LPS,60/~g/kg体重 腹腔内注射,3d,时后分离肝非实质细胞,继与 另--d'鼠的正常肝细胞混合培养.余同前. 二检测指标及其方法 在肉眼及倒置相差显微镜下观察病理形 态;以台盼蓝排除法计成活率.在镜下以1 ×100倍,计10个视野的存活及死亡肝细胞 数,计存活细胞的;取培养上清,经离心后去 除细胞沉渣,一2O.C冷冻保存待测AST.每一 指标数据均取自3份样本的均值 结果 一 ,病理形态观察 与LPSO/zg/ml对照组相比,LPS25#g/ . ml及lO0/zg/ml组肉眼见培养上清色略变红可见部分细胞浮游;镜下见已贴壁的肝细胞部 分松动或脱落,重者细胞间呈枝网状连接,胞核 及胞浆成分模糊不清.改变程度与LPS加入量 呈平行关系,并随时间延长而加重.经Ga1N和 作者单位:680038.重庆市.第三军医大学西南医院(王宇明); 日本蛀阜大学医学部0k西弘生武尊囊t);中国医科大学第三医 院(刘肺) LPS体内刺激的肝非实质细胞组.上述改变更 为显着,LPS6.25pg/ml组亦见明显改变 二,存活率 不同LPS浓度组与LPS0~g/ml对照组相 比,肝细胞存活率显着降低(P<0.oi).各LPS 浓度组间差异也有显着性(P<0.05,P< 0.01),详见表1经GalN和LPS体内刺激的肝细 胞一肝非实质细胞组肝细胞存活率更低,与肝细 胞组相比,在LPS0~g/ml及6.25g/ml组前者 存活率显着低于后者(P<O.05),详见表1 表1GalN,LPS体内作用后分离的肝非实 质细胞对LPS加入后24小时肝细胞存 活率的影响?S)(n一6) - ~LPS0g/mI对甩组相比P<O05-?P<0.01; jLPS加人量相同的肝细胞相比P<0.05 围1LPS对时肝细胞单擅培养丑肝细胞?肝非实质细胞中 肝细胞存括率的影响?s.n=5) 与LPS~g/ml相比,'P<005.?P<001 三,谷草转氨酶(AST) 见图2.LPS)~1人后24]J~时,肝细胞一肝非实 质细胞各组间AST差异有显着性(P<0.05, P<O.O1):肝细胞LPS25~g/ml与LPS10.0pg /ml组问差异有非常显着性(尸<O.O1). 中华消化杂志1994年l0月第14卷第5期 s(u 圈2LPS加人后24d,时^肝细胞单独培养及肝缉胞一肝非实质 细雅混合培养上清藏中AsT的变化士s)【?5)?P<0.05.?P <001 四,游离H_TdR 见表2.游离.H.TdR肝细胞单独和培养中 的LPS251"g/ml及LPS1OOg/ml两组显着高 于LPS0ug/ml组(P<O.05).肝细胞一Ku. pffer细胞混合培养中LPS6.25pg/ml,25~g/ ml及1OOg/ml组均显着高于LPSOg/ml组 (P<O.O1) 表2LPS:~f1人后肝细胞及肝细胞一Kupffer~胞培 养上清中游离H?TdR的变化(cpm,j?研(n=5) 与LPSO/*g/mlffi相比.P<O.05.P<O.O1 讨论 一 , LPS对肝细胞的直接毒性作用 近年来,LPS引起肝细胞损害的机制众说 纷云.据报道,在大鼠体外肝细胞培养中,未发 现LPS有直接肝细胞毒性作用:中村束树等 …则发现在GalN和LPS共同作用下肝细胞出 现明显损害.最近发现LPS可引起体外肝细胞 中华消化杂志1994年10月第L4卷第5期 形态明显损害.最近发现LPS可引起体外肝细 胞形态及功能变化,如肝细胞中的圆形细胞增 多且牯附功能消失,同时己糖摄取减少;肝细 胞.H一亮氨酸整合减少;22.KD蛋白质合成增 多;细胞色素P450水平降低".由于有关LPS 对体外肝细胞毒性作用的研究报道较少,加之 多采用大鼠肝细胞,为此我们对小鼠进行了有 关研究.结果发现,LPS对小鼠体外肝细胞有明 显损害作用,表现为肝细胞变性,坏死,存活率 降低,AST增高,上述改变程度与LPSJ]H人量成 正比;LPS的毒性作用在加入后12小时即已较 为明显,时间越长,作用越明显.岩城羲博等 报道在大鼠LPS加入量达500#g/ml时仍未见 肝细胞毒性作用,而在本实验中LPS低浓 度(6.25)~g/m1)时即见毒性作用造成此种差异 的原因尚不清楚.如果确与动物种系不同有关, 今后以人胎培养肝细胞进行研究,对于临床有 更为直接的意义.另外,本实验采用无血清和血 清培养(10小牛血清),得出相似结果,说明血 清不象是影响LPS毒性作用的主要因素. 二,肝非实质细胞在LPS所致肝细胞损害 中的作用 一 般认为,肝非实质细胞在LPS所致肝细 胞损害中起重要作用其中Kuffer细胞一方面 具有吞噬,清除LPS的功能;另一方面,它又可 被LPS激活,通过多种途径(如产生白细胞介素 一 1及肿瘤坏死因子)引起肝细胞损害.肝血窦内 皮细胞可因LPS直接作用而损伤,从而激活内 凝系统,诱发DIC,是为Shwartzman反应 对于Kupffer细胞的保护及致伤作用,很有 研究必要.不仅有助于阐明LPS所致肝细 胞损害的机理,而且对其治疗也有重要的指导 意义.本实验中的肝非实质细胞主要为Ku. pffer细胞.从结果来看,肝细胞单独培养组及 肝细胞一肝非实质细胞混合培养组在LPSJ]~A 后,两组间各指标变化差异无显着性,故未能证 实关于LPS刺激肝非实质细胞,导致肝细胞损 害加重以及Kupffer细胞通过吞噬,清除LPS, 从而保护肝细的两种说法;提示正常肝非实质 细胞对体)bLPS所致肝细胞损害影响不大.然 而,如将肝非实质细胞的数量及LPS的加人量 加以调整,结果是否一样,尚待进一步研究. 值得注意的是,在体内经GalN及LPS预 处理,引致肝受损后分离的肝非实质细胞,与正 常肝细胞进行混合培养,再经LPS作用,此时肝 非实质细胞的存在不仅加重经LPS处理的肝细 胞损害,而且对未加IPS的正常肝细胞也有轻 度损伤作用.游口靖等对小鼠及太鼠静 注灭活丙酸菌(P.acnes),7天后分离肝粘着细胞 (hlKupffer细胞),经与同种肝细胞混合培养, 并加入LPS,结果出现明显肝细胞损害,认为此 损害为LPS激活Kupffer~胞,生成肝细胞损伤 因子有关,本实验结果与其一致.然而,为何 LPS体外单独作用则未对Kupffer细胞产生此 种激活效应?推测此种激活效应可能依赖于体 内某些因素的参与;或者,由于给小鼠GalN和 LPS后很快导致肝损害,此时Kupffer细胞可能 已产生明显的功能变化,从而引起肝细胞损害, 这将有待于进一步研究. 参考文献 1SomaniP,etalAmiodearoneanddesethy— lamiodarone—inducedmyelinoidinclusionbo- die6andtoxicityinculturedrathepatocytesHepa- tology1980;II:81 2WestMA.eta1.KilledEscherichiacolistimulates alterationsinhepatocellu- larfunctionduringinvitrococulture:a mechanismofalteredliverfunctioninsepsisInfect Irnmun1985;49:563 3岩城羲博.他D.,}廿'y肝障喜0凳生机序?朋 于与研究-肝廉1988;29:1043. 4.中村柬错.他韧代培羹于肝棚胞{=封于5工F* ,y0亩接作用.各川久一桶集肝氟橱壁栅胞研究0遣步 (第二巷).柬京:国I祭医謇出版.19帅:248. 5.PaganiILetalMorphologicaldamageinduced byEscherichiacolilipopolysaccharideincultured hepatocytes:loca~onandbindingproperties.Br 280中华消化杂志1994年10月第14卷第5期 JExpPath1988;6~537.culturesEurJCellBiol1987;43:243 6Mazu日kiJE,eta1.DirecteffectBofendotoxin8j尊口蚰l他寅胺的急性肝不全-E,0 研究——Pr0. onhepatocytes.ArchSug1988;123:340pionib{i'tcriumaeDes0臆器丹布阜核栅孢浸祸 7PaganiR.etalDirectandmediatedEscherichia能日龋免志1989;12:71 eolilipopolysaccharideactioninprimaryhepatocyte嫩稿:1981-09-i0) THERoLEoFNoNPARENCHYMALHEPAToCYTESIN LIPoPoLYSACCHARmE.INDUCEDCYToT0XICITYoN CULTUREDMoUSEHEPAToCYTES ngYu-ming.0nishiHiroo.MutoYas?toshi,eta1. DepartmentofInfectio"sDiseases.SouthwestHospital. eirdMilitaryMedicalUniversity. Thedirecteytotoxicityonculturedmousehepatoeytesindueedbylipopolysaeeha~de (LPS)wasstudied,andtheresultsshowedthatthehepatoeytotoxieityinducedbyLPSwas defmiteandsignifieant.DegenerationandnecrosisofeuIturedhepatocytes,decreaseof hepatocyteviabilityandincreaseofASTlevelinsupernatantwerefound.Thedegreeof above-mentionedchangesparalleledwiththeconcentrationofLPSadded.Theresul_cBof variousparametershadnosignificantdiffereneebetweenthegroupofhepatocytescultured aloneandthatofhepatocyteseoeulturadwithnonparenehymalhepatocytes.Ifthe nonparenehymalhepatoeytes,however,separatedfromthemicepretreatedwithD-galaetos. amine(GaLN)andLPSsubsttitutedforthe1101311alnonparenehymalhepatoeytes,itnotonly enhancedthehepatocytotoxieityinducedbyU)s,butalsohadcertaineytotoxieityon culturedhepatecytesevenWithouttheadditionofLPS. Keywords:Lipopolysaeeharide(LPS);Culturedhepatocytes;Nonparenehymalhepato' trtes:Cyfotoxicity:Mice. 广东省第一次消化内镜 及第五次消化病系学术会议在肇庆召开 广东省第一次消化内镜和第五次消化系病学术 会议于1994年5月28~30El在肇庆市联合召开.来 自全省各地区的代表283人出席了会议,收到论文 356篇,大会专题报告9篇.其中大会交流2O篇,小会 交流150篇,内容丰富涉及面广,比较全面的反映了 近年来广东省消化内镜和消化系病基础研究和I临床 诊疗的进展情况,如幽门螺杆菌相关性疾病的流行 病学基础和治疗研究,食道狭窄性疾病的内镜治疗 (如嘭胀式金属支架治疗食管狭窄),大肠癌的基础和 防治,肝胆胰介人性治疗的进展(如经胆道镜液电碎 石),消化系肿瘤生物祜疗,抗人胰腺瘟单克隆抗体的 制备和应用,经颈静脉肝内门腔分流术,微波 治疗的应用,新药西沙必利,蓝索拉唑,生长抑素等 的临床应用等有关内容,均引起了代表们的极大兴 趣. 会议期问消化系病学会进行了换届改选,第四 届委员会由33名委员组成,一致推举周段元为名誉 主任委员,选举张万岱为主任委员,刘健玻,袁世 珍,囊爱力(按姓氏笔iq排列)为副主任委员. 另广东省医学会消化内镜学会于l993年lo.q正 式成立,第一届委员会由3o名委员组成,一致推举周 殿元为名誉主任委员,选举章天予为主任委员,冯摇 才胡品津李瑜元为副主任委员. (杨希山) :=?一讯一 一简一