【word】 三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响

【word】 三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响 三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式 的影响 ? 5l6?徐州医学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(8) 三磷酸腺苷对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响 陈党英 (中国人民解放军第九七医院普外科,江苏徐州221004) 摘要:目的研究三磷酸腺苷(ATP)对大鼠移植胰腺细胞死亡方式的影响,探讨ATP对大鼠移植胰腺缺血 再灌注损伤的作用及相关机制.方法sD大鼠102只,随机分为假手术组,单纯移植组和ATP保护组,后2组按 再灌注时间再各分为0,l,6,12h亚组,单纯移植组供体胰腺单纯用肝素平衡盐液进行低温(0—4~C)灌注并保存 60min后行移植手术,ATP保护组供体胰腺用添加了ATP的肝素平衡盐液进行低温(0—4?)灌注并保存60min 后行移植手术.观察ATP对血糖,血清脂肪酶,淀粉酶含量和胰腺组织病理学变化的影响,研究胰腺组织ATP含 量与凋亡,胀亡细胞百分比的关系.结果ATP保护组胰腺组织病理损伤明显轻于单纯移植组,再灌注6,12h ATP保护组血糖,血清淀粉酶,脂肪酶含量明显低于同时间点单纯移 植组(血糖,脂肪酶,P<0.05;淀粉酶,P< 0.01),再灌注0,lhATP保护组胰腺组织ATP含量明显高于同时问点 单纯移植组(P<0.01),ATP保护组胀亡 细胞百分比明显小于同时间点单纯移植组 (0,l,6h,P<0.01;12h,P<0.05),ATP保护组细胞的主要死亡方 式是凋亡,ATP含量与胀亡细胞百分比明显负相关(r=一 0.956,P<0.O1),与凋亡细胞百分比无明显相关.结 论ATP促进移植胰腺的不可逆损伤细胞以凋亡方式死亡,减少细胞 胀亡的发生. 关键词:胰十二指肠移植;三磷酸腺苷;细胞凋亡;细胞胀亡 中图分类号:R657.5文献标识码:A文章编 号:1000—2065(2007)08—0516—04 Effectsofadenosinetriphosphateonthedeathpatternofgraftpancreatic cellstransplantedindiabeticratmodels CHENDang—ying (DepartmentofGeneralSurgery,the97thHospitalofPLA,Xuzhou,Jjiangsu221004,China) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectsofadenosinetriphosphate(ATP)onthedeathpatternoftransplanted pancreaticcellsindiabeticratmodelstoexploretheprotectivemechanismofATPagainsttheI/Rinjuryofthegraft. Methods102drug—induceddiabeticSDratswererandomizedinto3groups:shamoperationgroup,simpletransplant groupandATPprotectiongroup.ThelattertwogroupswerefurtherdividedintosubgroupsOh,1h,6hand12haccord— ingtothestarttimepointsofreperfusionrespectivly.Theisolatedpancreasfromdonorratwas(re一)perfusedwithcalci— parinebalancedsalineandstoredat0—4~Cfor60minbeforetransplantation. ATPasanadditiveagentwasaddedtothe salineusedintheATPprotectiongroup.nottothatforthesimpletransplantgroup.Bloodsugar.plasmaamylaseandli— paseconcentrations,andATPcontentinpancreatictissue,weredeterminedwhentherecipientratswerekilledtoperform histopathologicalstudylater.Thepercentagesofnormal,apoptotic,oncoticandnecroticcellsweredeterminedbyflow cytometry.ResultsItwasf0undthatthehistomorphologicalchangesofpancreasinATPgroupweremuchmilderthan thoseinsimpletransplantgroup.Thebloodsugar,plasmaconcentrationsofamylaseandlipaseweresignificantlylowerin theATPsubgroups6hand12hthaninthecorrespondingsimpletransplantsubgroups(P<0.05,P<0.01).Thetis— sueconcentrationofATPwashigherintheATPsubgroups0hand1hthaninthatofsimpletransplantgroup(P< 0.01).ThepercentageofoncoticcellswassignificantlylowerinallATPprotectionsubgroupsthaninthoseofthesimple transplantgroup(P<0.0l,P<0.05);thedeadcellsweremainlyapoptoticonesinATPgroup.Thetissueconcentra- tionofATPwasnegativelycorrelatedwiththepercentageofoncoticcells(r=一0.956,P<0.O1),butnotcorrelated withthatofapoptoticcells.ConclusionATPcanpromotetheinconvertibly— damagedcellstodieofapoptosisandde— creasethedevelopmentofoncosis. Keywords:pancreaticoduodenaltransplantation;adenosinetriphosphate;apoptosis;oncosis 缺血再灌注损伤(I/RI)导致的胰腺细胞死亡是胰腺移植术后移植胰 腺功能不良的主要原.近 徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(8) 年来的研究明,细胞死亡方式包括凋亡与胀亡,凋 亡是需要三磷酸腺苷(ATP)参与的主动性细胞死亡, 胀亡是细胞缺乏ATP时的被动性死亡;由于胀亡 可以引起严重的炎症反应,凋亡是一种更有利于机体 的细胞死亡方式.有资料显示,外源性ATP能 够进入低温保存的胰腺细胞内.我们利用在器官灌 注保存液中加入外源性ATP的方法提高胰腺组织 ATP含量,研究ATP对移植胰腺细胞死亡方式的影 响,探索新的保护移植胰腺缺血再灌注损伤的方法. 1材料和方法 1.1实验动物与分组健康清洁级,近交系封闭群 sD大鼠102只,均为雄性,体重250,300g,徐州医 学院实验动物中心提供.随机分为假手术组(6 只),单纯移植组和ATP保护组,后2组按再灌注时 间再各分为0,1,6,12h亚组(每亚组12只).假手 术组仅行开腹及暴露胰腺手术,单纯移植组供体胰 腺单纯用肝素平衡盐液进行低温(0,4?)灌注并 保存60min后行移植手术,ATP保护组供体胰腺用 添加了5mmol/LATP的肝素平衡盐液进行低温(0 , 4?)灌注并保存60min后行移植手术. 1.2动物模型制作采用张召辉,李玺j方法行 大鼠胰十二指肠移植,建立大鼠移植胰腺I/RI模 型.切除受体左肾,将供体带腹腔动脉和肠系膜上 动脉的腹主动脉段与受体腹主动脉端侧吻合,供体 门静脉与受体左肾静脉行端端吻合,供体的十二指 肠远端与受体上段空肠作端侧吻合. 1.3围术期处理实验前1周受体大鼠经阴茎背 静脉按55mg/kg一次注入链脲霉素(美国Sigma公 司)制备空腹血糖?16.8mmol/L的糖尿病模型. 术前禁食不禁水24h,肌注氨苄青霉素 (100mg/kg)预防感染.于时间点抽血后处死 动物并切取胰腺行各项检查. 1.4血糖,血清淀粉酶,脂肪酶检测血糖测定采 用美国强生血糖仪,淀粉酶,脂肪酶测定采用日立 7600—010型全自动生化仪. 1.5组织病理学检查切取部分胰腺标本制成石 蜡切片后行苏木精一伊红染色,每只动物取2张切 片在光学显微镜下观察组织细胞形态学改变,采用 Schmidt方法由2位病理科医师进行双盲评分. 1.6胰腺组织ATP含量测定切取胰腺组织约 0.5cm×0.5cm×0.5cm,应用岛津SCL一10AVP 高效液相色谱仪以反相高效液相色谱法测定胰腺组 织ATP含量. 1.7凋亡和胀亡细胞百分比测定取胰腺组织 1g,生理盐水洗净,剪碎,振荡后300目筛网过滤, 收集细胞制成细胞悬液,调整细胞至1X10个/L, 加标记有异硫氰酸荧光素的联结素V(AnnexinV— FITC,上海晶美生物工程有限公司)与碘化丙锭 (PI,美国Sigma公司),混匀双染色.避光冰浴1O min,使用流式细胞仪检测各类细胞百分比.结果判 断:正常活细胞(AnnexinV一,PI一),胀亡细胞(An— nexinV,PI),凋亡细胞(AnnexinV,PI一),坏死 细胞(AnnexinV一,PI). 1.8统计学处理数据以面?s表示,采用q检验 及相关分析,P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1组织病理学变化光镜下,假手术组未见明显 异常表现;单纯移植0h亚组胰腺细胞轻度水肿, 1h亚组炎性细胞浸润明显,6h,12h亚组,腺泡坏 死,出血和炎症细胞浸润严重;ATP保护组与单纯移 植组相比,细胞水肿,炎细胞浸润,出血及腺泡坏死 均明显减轻.胰腺组织病理学评分明显降低(水 肿,出血,炎细胞浸润评分,P<0.05;腺泡坏死评 分,P<0.01).见表1. 表1各组大鼠胰腺组织病理学评分(x?s) 与假手术组比较:P<0.01;与同时间点单纯移植组比较:#P<0.05,##P<0.01 徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(8) 2.2血生化变化ATP保护组再灌注6,12h后血组明显降低(P<0.05 或P<0.01).见表2. 糖,血清淀粉酶和脂肪酶含量均较同时点单纯移植 表2各组大鼠血糖,血清淀粉酶,脂肪酶含量(哥?) 与假手术组比较:}P<0.05,}}P<0.0l;与同时间点单纯移植组比较:#P<0.05,##P<0.01 2.3胰腺组织ATP含量和胀亡,凋亡细胞百分比 的变化ATP保护组再灌注0,1h时胰腺组织ATP 含量较相应单纯移植组明显增高(P<0.01),ATP 保护组各时间点胀亡细胞百分比较相应单纯移植组 均明显降低(P<0.05),ATP保护组胰腺细胞的死 亡方式主要是凋亡,ATP含量与胀亡细胞百分比明 显负相关(r=一0.956,P<0.01),与凋亡细胞百 分比无明显相关.见表3. 表3各组大鼠胰腺组织胀亡,凋亡,坏死,正常细胞百分比(?s) 与假手术组比较:}P<0.05,}}P<0.01;与同时点单纯移植组比较:#P<0.05,##P<0.01 3讨论 有学者研究发现,低温保存的肝脏细胞内ATP 水平与移植后肝脏活力密切相关,Bowers等提 出低温保存器官移植前细胞内ATP水平是判定保 存器官活力的一项重要指标.本实验结果显示,单 纯移植0h,1h亚组胰腺组织ATP含量较假手术组 显着降低,ATP保护0h,1h亚组胰腺组织ATP含 量较相应单纯移植组显着升高,说明在器官灌注保 存液中添加外源性ATP可以增加大鼠胰腺组织ATP 含量.结果同时显示,ATP保护组胰腺组织病理评 分较相应单纯移植组显着降低,再灌注6,12h后血 清淀粉酶,脂肪酶,血糖含量较相应单纯移植组显着 降低,说明ATP可以减轻大鼠移植胰腺病理损伤, 改善大鼠移植胰腺内分泌功能,即ATP可以减轻大 鼠移植胰腺I/RI.根据本实验结果,ATP保护组在 胰腺组织ATP含量显着高于单纯移植组的同时,胰 腺细胞主要以凋亡方式死亡,说明外源性ATP促进 不可逆损伤的胰腺细胞以凋亡的方式死亡;ATP保 护组在胰腺组织ATP含量显着高于单纯移植组的 同时,胀亡细胞百分比显着小于单纯移植组,并且统 计分析提示胰腺组织ATP含量与胀亡细胞百分比 显着负相关,说明外源性ATP可以减少移植胰腺细 胞胀亡的发生.统计分析提示:ATP含量与凋亡细 胞百分比无明显相关,与ATP促进胰腺细胞凋亡并 不矛盾,细胞凋亡是需要ATP参与的程序性细胞死 亡,但凋亡有自身的变化规律.缺血再灌注导致细 胞损伤后,在ATP充足的情况下,不可逆损伤细胞 徐州医学院 ACTAACADEM1AEMEDICINAEXUZHOU2007,27(8)?519? 发生凋亡,凋亡高峰一般位于再灌注1,3h,然后会 呈减少趋势;不可逆损伤细胞在缺乏ATP时无法启 动凋亡程序,则会发生胀亡. 由于细胞以凋亡的方式死亡远比以胀亡的方式 死亡对组织的损害要轻,提示促进细胞凋亡,减少细 胞胀亡可能是外源性ATP保护大鼠移植胰腺I/RI 的重要机制.当I/RI不可避免时,减少缺血所引起 的缺氧及能量消耗这一始动因素,如在术前或术中 给予能量物质暂时提高组织细胞能量储备,有利于 促进受损细胞以凋亡方式死亡,减少细胞胀亡的发 生,从而减轻移植器官I/RI. 参考文献: [2] [3] [4] [5] [6] [7] DrognitzO,LiuX,BenzS,eta1.1schemia/reperfusioni~uryin一[8] ducesacinarcellapoptosisinexperimentalpancreastransplantation [川.TransplantProc,2002,34(6):2361—2362. HeinS,ArnonE,KostinS,eta1.Progressionfromcompensated hypertrophytofailureinthepressure—overloadedhumanheart: structuraldeteriorationandcompensatorymechanisms[J].Circula— tion,2003,107(7):984—991. FischerS,MacleanAA,LiuM,eta1.Dynamicchangesinapop— toticandnecroticcelldeathcorrelatewithseverityofischemia— reperfusioninjuryinlungtransplantation[J].AmJRespirCrit CareMed,2000,162(5):1932—1939. 原春辉,刘永锋,李桂臣,等.外源性腺苷三磷酸对移植胰腺再 灌注损伤保护作用的实验研究[J].消化外科,2004,3(4): 274—277. 张召辉,李玺.大鼠胰十二指肠移植模型制作的手术技巧 [J].医学研究生,2004,17(9):785—787. SchmidtJ,RatterDW,LewandmwskiK,eta1.Abettermodel0f acutepancreatitisforevaluatingtherapy[J].AnnSurg,1992,215 (1):44—56. 李幼生.低温保存器官的能量代谢与生存能力的关系[J].中 华器官移植杂志,1995,16(4):185—187. 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