雷洛昔芬对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖、分化及矿化能力的影响

雷洛昔芬对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖、分化及矿化能力的影响 雷洛昔芬对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖、分化及 矿化能力的影响 雷洛昔芬对体外培养人牙周膜成纤维细胞 增殖分化及矿化能力的影响 骆凯1陈玉玲1陈凌2闫福华1 5 10 15 1 福建医科大学口腔医学院福州 350002 2 福建医科大学附属第一医院口腔科福州 350004 摘要目的 探讨雷洛昔芬对体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞的增殖分化及体外矿化 能力的影响方法 采用组织块法体外分离培养人牙周膜成纤维细胞分别给予不同浓度的 雷洛昔芬进行培养以 17β-雌二醇10-8 M为阳性对照组单纯 DMEM 培养液为空白 对照组观察雷洛昔芬对人牙周膜成纤维细胞的增殖分化和体外矿化能力的影响结果 与 对照组相比 17β-雌二醇及不同浓度10-9M,10-6M雷洛昔芬可显著刺激人牙周膜成纤维 细胞的增殖P 001雷洛昔芬最大促增殖浓度是 10-8M17β-雌二醇及不同浓度10-9M, 10-7M雷洛昔芬可显著提高人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶的表达P 001但 10-6M 雷 洛昔芬对细胞碱性磷酸酶表达无明显的促进作用P 00517β-雌二醇及不同浓度10-8 及 10-7 M雷洛昔芬可显著提高人牙周膜成纤维细胞体外矿化能力与对照组相比差异有 显著性P 00510-7 M 雷洛昔芬对细胞体外矿化能力的作用最明显结论 雷洛 昔芬可 提高体外培养的人牙周膜成纤维细胞的增殖分化及矿化能力 关键词雷诺昔芬雌二醇牙周膜成纤维细胞 中图分类号R781 420 2 20 Effect of raloxifene on the proliferation differentiation and mineralization of human periodontal ligament fibroblasts in vitro LUO Kai1 CHEN Yuling1 CHEN ling2 YAN Fuhua1 25 30 35 40 1 The School of Stomatology Fujian Medical University FuZhou 350002 2 The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University FuZhou 350004 Abstract Objective To study the effects of raloxifene RAL on the proliferation differentiation and mineralized nodules formation of human periodontal ligament fibroblasts HPDLFs in vitro Methods The HPDLFs were cultured in vitro and the effect of 17β-estradiol EST and RAL on the proliferation differentiation and mineralized nodules production of HPDLFs were investigated Results EST 10-8M and RAL 10-9M10-6M were both able to enhance the HPDLFs proliferation P 001 The imally effective dose of RAL was 10-8M Compared with control groups EST and RAL could significantly promote the alkaline phosphatase ALP expression P 001 and mineralized nodule formation of HPDLFs P 005 The imally effective dose of RAL at mineralized nodule formation was 10-7M Keywords raloxifene 17β-estradiol periodontal ligament fibroblasts 0 引言 牙周炎与绝经后骨质疏松 postmenopausal osteoporosis PMO 均是中老年人常见病及多 发病当前大多数学者的研究肯定了 PMO 与牙周炎间存在一定的联系是牙周炎的危险因 素[12]PMO 治疗药物在提高机体骨密度改善全身性骨质疏松的同时可在一定程度上防治 PMO 患者牙周炎牙槽骨的吸收但其具体的作用还不明确选择性雌激素受体调节剂 selective estrogen receptor modulators SERMs 是一组人工合成的结构不同的非类固醇化合 基金项目教育部博士点新教师基金 20093518120003 作者简介骆凯1976-男副教授牙周病的基础及临床研究 E-mail luokai39163com -1- 物可选择性地作用于不同组织的雌激素受体estrogen receptorER在不同的 靶组织 45 分别产生类雌激素或抗雌激素作用研究显示 SERMs 类药物雷洛昔芬raloxifeneRAL 可明显抑制体外培养破骨细胞的形成但对成骨细胞有刺激作用可促进成骨细胞的增殖及 分化[3 4] 本实验拟观察 RAL 对体外培养的人牙周膜成纤维细胞periodontal ligament fibroblastsPDLFs的增殖分化及体外矿化能力的影响为进一步探讨 PMO 治疗药物防 治牙周炎的机制提供实验依据 50 55 60 65 70 75 80 1 材料和方法 11 主要仪器和试剂 超净工作台Hfsafe-1200上海力申科学仪器有限公司CO2 孵箱Heraeus德国 倒置显微镜及照相系统OLYMPUS日本Humareader 酶标仪 Human德国 DMEM 培养液 Gibco美国 胰蛋白酶 Gibco美国 新生牛血清 Hyclon 美国 盐酸雷洛昔 芬raloxifeneRALSigma 美国17β-雌二醇17β-estradiolESTSigma 美国 β-甘油磷酸钠Sigma美国四唑盐 MTT Sigma 美国碱性磷酸酶alkaline phosphatase ALP试剂盒南京建成生物工程研究所 12 人 PDLFs 的体外培养 收集因正畸拔除的前磨牙要求无龋坏根尖周炎及牙周病牙拔出后即放入装有无血 清 DMEM 培养液的小瓶中在超净工作台内用含有抗生素青霉素 100μml链霉素 100μgml的 PBS 反复冲洗刮取根中 13 牙周膜组织均匀铺于六孔培养板底面其上覆 盖玻片沿盖玻片边缘加入少许含 20, FBS 的 DMEM 培养液在饱和湿度5,CO237 ?标准环境下静置孵育2h 后待组织块贴壁牢固再加入 4ml 20, FBS 的 DMEM 培养液 继续培养倒置相差显微镜下观察细胞生长情况待原代人 PDLFs 细胞从组织块周围游出 并铺满培养板底 70左右时用 025 胰蛋白酶及 01 EDTA 消化传代取 4,6 代细胞 用于实验 13 实验分组 将 RAL 用 DMEM 稀释使其终浓度分别为 10-910-810-7 及 10-6 M分别记为 RAL1 RAL2RAL3 及 RAL4以 10-8 M 的 17β-雌二醇为阳性对照组EST单纯 DMEM 培养 液为空白对照组CON 14 RAL 对人 PDLFs 增殖的溶度效应 取生长状态良好的人 PDLFs调整细胞浓度至 2×105L 接种于 96 孔培养板培养 24h 使其贴壁根据实验分组分别加入不同终浓度的 RALEST 及单纯 DMEM 培养液每组设 3 复孔标准环境下孵育 72h 后每孔加入 20μl MTT继续孵育 4h 后吸弃孔内液体每 孔加入 150μl 的 DMSO震荡 10min用酶联免疫检测仪在 492nm 波长下检测 OD 值每孔 测 3 次取其均值 15 RAL 对人 PDLFs 碱性磷酸酶ALP表达的影响 取生长状态良好的人 PDLFs调整细胞浓度至 1×105L 接种于 24 孔培养板内培养 24h 使其贴壁根据实验分组分别加入不同终浓度的 RALEST 及单纯 DMEM 培养液每组设 6 个复孔培养 72h 后加入 01,TritonX-100裂解细胞吸取细胞裂解上清液按照检测 -2- 试剂盒说明书方法测定各组 ALP 浓度以同样品总蛋白浓度进行校正 16 RAL 对人 PDLFs 体外矿化能力的作用 参照文献[5]取生长状态良好的人 PDLFs调整细胞浓度至 1×108L接种于 6 孔培养板 内每孔接着细胞悬液 3mlCO2 孵箱标准环境下培养 24h使其贴壁更换含 10nM β-甘 85 90 95 100 105 油磷酸钠培养液培养根据实验分组分别加入不同终浓度的 RALEST 及单纯 DMEM 培养 液每组设 6 个复孔每 3 天更换一次培养液于培养第 28 天进行 Von-Kossa 染色分别 计算各组各孔内矿化结节的个数取其均值进行统计学分析 17 统计方法 结果以均数?标准差表示采用 SPSS115 for windows 进行统计分析组间比较采用方 差分析显著性 t 检验P 005 为差异有统计学意义 2 结果 21 人 PDLFs 的培养 体外培养 10d 左右细胞即可从组织块中长出镜下观察可见人 PDLFs 为长梭形或纺 锤形胞体丰满胞浆均匀核呈圆形或卵圆形随着培养时间的延长细胞增殖活跃长 满单层时呈漩涡状外观 22 RAL 对人 PDLFs 增殖的浓度效应 RAL 对人 PDLFs 增殖的浓度效应见图 1与对照组相比 EST 及不同浓度 RAL 均可显 著刺激人 PDLFs 的增殖P 001最大促增殖浓度是 10-8MRAL 各组组间及与 EST 间 比较无显著性差异P 005 图 1 雷洛昔芬RAL对人 PDLFs 增殖的影响 CON对照组RAL110-9M RALRAL210-8M RAL RAL310-7 M RALRAL410-6 M RALEST10-8M 17β-雌二醇,与对照组比较 P 001 Fig1 Effect of RAL on human PDLFs proliferation CON control group RAL1 RAL in 10-9M RAL2 RAL in 10-8M RAL3 RAL in 10-7M RAL4 RAL in 10-6 M EST 17β-estradiol in 10-8M , Compared with control group P 001 23 RAL 对人 PDLFs ALP 表达的影响 RAL 对人 PDLFs ALP 表达的影响见图 2与对照组相比EST 及不同浓度10-910-8 及 10-7 MRAL 均可显著提高人 PDLFs ALP 的表达P 001但 10-6M RAL 对细胞 ALP -3- 110 115 120 125 表达无明显的促进作用P 005反而下调了 ALP 的表达量 图 2 雷洛昔芬RAL对人 PDLFs 碱性磷酸酶表达的影响 CON对照组RAL110-9M RALRAL2 10-8M RALRAL310-7M RALRAL410-6M RALEST10-8M 17β-雌二醇,与对照组比较 P 001 Fig2 Effect of RAL on alkaline phosphatase expression of human PDLFs CON control group RAL1 RAL in 10-9M RAL2 RAL in 10-8M RAL3 RAL in 10-7M RAL4 RAL in 10-6M EST 17 β-estradiol in 10-8M, Compared with control group P 001 24 RAL 对人 PDLFs 体外矿化能力的作用 人 PDLFs 体外连续培养 28 天各组细胞均可见细胞复层生长局部增厚出现肉眼可见 的结节并逐渐增大图 3Von-Kossa 染色结节被染成黑色边界不均匀显示为钙盐沉 积部位图 4各组不同时间点矿化结节形成情况见图 5EST 及不同浓度10-8 及 10-7 M RAL 可显著提高人 PDLFs 体外矿化能力与对照组相比差异有显著性P 00510-7 M RAL 对细胞体外矿化能力的作用最明显但与 EST 组相比无显著性差异P 005 图 3 人 PDLFs 体外培养形成的矿化结节相差显微镜 x20 Fig3 The mineralized nodule formation of human PDLFs cultured in vitro phase microscope x20 -4- 图 4 人 PDLFs 矿化结节 Von-Kossa 染色 x20 Fig4 Von-Kossa stain of mineralized nodule x20 130 135 140 145 150 图 5 雷洛昔芬RAL对人 PDLFs 体外矿化能力的影响 个孔 CON对照组RAL110-9M RAL RAL210-8M RALRAL310-7M RALRAL410-6M RALEST10-8M 17β-雌二醇,与对照组比 较 P 005 Fig5 The effect of RAL on the mineralized nodule formation of human PDLFs cultured in vitro CON control group RAL1 RAL in 10-9M RAL2 RAL in 10-8M RAL3 RAL in 10-7M RAL4 RAL in 10-6M EST 17β-estradiol in 10-8M , Compared with control group P 005 3 讨论 近年来的研究证实 PMO 是牙周炎的危险因素可影响牙周组织加重牙周组织的炎症 反应但其具体的作用机制及 PMO 治疗药物对牙周组织的影响还不明确大量研究发现 PDLFs 是牙周组织中主要的细胞成分具有多向分化潜能可分化为成纤维细胞成骨细 胞和成牙骨质细胞在牙周支持组织的发育功能及再生中发挥重要作用[6]有关 SERMs 类药物 RAL 对 PDLFs 的增殖及分化的影响还鲜见报道因此本实验以 EST 为参照探 讨 RAL 对体外培养 PDLFs 增殖分化及体外矿化能力的影响进行评价 衡量一种细胞成骨表型特征的标准包括[7]产生骨相关物质如骨基质成分和 ALP 等 对骨调节激素的特征性表达以及具有成骨能力ALP 是参与骨组织形成代谢和再生的 重要调节物质是细胞分化活跃和具有成骨能力的重要标志其活性高低可反映组织细胞 向成骨方向分化的趋势[8]本研究结果发现 RAL 与 EST 一样对人 PDLFs 具有显著的促增殖 作用且 RAL 的增殖作用呈一定的浓度效应同时一定浓度的 RAL 还可明显提高体外培养 PDLFs ALP 表达及矿化能力上述结果提示 SERMs 类药物 RAL 对体外培养的人 PDLFs 具 -5- 有类雌激素作用 EST 与 RAL 对的生物学作用主要通过作用于靶组织表面 ER 来完成ER 包括 ERα 及 ERβ 两种受体亚型不同亚型在体内各组织的分布及表达水平不同ERα 主要表达于乳腺 子宫阴道骨和其他一些靶器官ERβ 的组织分布局限于卵巢前列腺睾丸骨脾 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 肺下丘脑和胸腺[9]1986 年 Lewko 等首次报道体外培养的人 PDLFs 表面具有高亲和力的 ER[10]Morishita 等研究认为 EST 主要是通过与细胞表面的 ERα 相作用引起的尽管表达 较低[11]Jonsson 等采用免疫细胞化学方法检测发现人 PDLFs 表面主要表达 ERβ并未检测 到 ERα认为 EST 对人 PDLFs 的作用主要是通过细胞表面的 ERβ 进行[12]本实验结果表明 EST 对人 PDLFs 具有显著的促增殖作用同时还可明显提高细胞的体外矿化能力该结果 与以往报道的一致[5]因此我们推测 RAL 对人 PDLFs 增殖及分化的作用应该与 RAL 与 细胞表面 ER 作用后产生的结构改变等因素有关但具体是通过 ERα 或和 ERβ 调节人 PDLFs 的生物学活性还有待与进一步的研究 本研究还发现在本实验条件下 RAL 虽然对体外培养的人 PDLFs 具有类雌激素作用且 对细胞的增殖作用呈现一定的浓度效应但在细胞 ALP 表达及体外矿化能力作用方面并未 表现出浓度效应高浓度 RAL10-6 M作用于细胞反而有下调细胞 ALP 表达及矿化能 力的趋势该作用特点是否是由于 RAL 具有类雌激素或抗雌激素作用高浓度 RAL 作用于 人 PDLFs 时表现出抗雌激素作用还有待深入研究有关 RAL 对人 PDLFs 生 物学活性影 响的研究将有助于深入探讨 PMO 治疗药物防治 PMO 患者牙周炎牙槽骨吸 收的作用机理 4 结论 雷洛昔芬可提高体外培养的人牙周膜成纤维细胞的增殖分化及矿化能力 [参考文献] References [1] Jeffcoat M The association between osteoporosis and oral bone loss[J] J Periodontol 200576 11 Suppl 2125-2132 [2] Otomo-Corgel J Osteoporosis and osteopenia implications for periodontal and implant therapy[J] Periodontol 2000 201259 1 111-139 [3] Taranta A Brama M Teti A De luca V Scandurra R Spera G Agnusdei D Termine JD Migliaccio S The selective estrogen receptor modulator raloxifene regulates osteoclast and osteoblast activity in vitro[J] Bone 200230 2 368-376 [4] 郭凌岑刘嘉茵张克勤张红梅龚健 雷洛昔芬对大鼠成骨细胞增殖分化及 TGF-β表达的影响[J] 江苏大学学报 医学版 2007174325-328 [5] Morishita M Yamamura T Shimazu A Bachchu AH Iwamoto Y Estradiol enhances the production of mineralized nodules by human periodontal ligament cells[J] J Clin Periodontol 199926748-51 [6] 骆凯闫福华金岩刘源赵宇董蕊 体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨 表型特征检测[J] 口 腔医学20042418-10 [7] Arceo N Sauk JJ Moehring J Foster RA Somerman MJ Human periodontal cells initiate mineral-like nodules in vitro[J] J Periodontol 1991 62 8 499-503 [8] Pavlin D Dove SB Zadro R Gluhak-Heinrich J Mechanical loading stimulates differentiation of periodontal osteoblasts in a mouse osteoinduction modeleffect on type I collagen and alkaline phosphatase genes[J] Calcif Tissue Int 2000 67 2 163-72 [9] Couse JF Lindzey J Grandien K Gustafsson JA Korach KS Tissue distribution and quantitative analysis of estrogen receptor-alpha ERalpha and estrogen receptor-beta ERbeta messenger ribonucleic acid in the wild-type and ERalpha-knockout mouse[J] Endocrinology 1997 138 11 4613-21 [10] Lewko WM Anderson A Estrogen receptors and growth response in cultured human periodontal ligament cells[J] Life Sci 1986 39 13 1201-06 [11] Morishita M Shimazu A Iwamoto Y Analysis of oestrogen receptor mRNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in human periodontal ligament cells Arch Oral Biol 1999 44 9 781-3 [12] Jnsson D Andersson G Ekblad E Liang M Bratthall G Nilsson BO Immunocytochemical demonstration of estrogen receptor beta in human periodontal ligament cells[J] Arch Oral Biol 2004 49 1 85-8 -6-