核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制

核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制 核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV 对核苷类药物的耐药机制 中国抗生素杂志2009年4月第34卷第4期?l93? 文章编号:1001—8689(2009)04.0193—07 核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制 李世学-刘建利-t?何伟. (1西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,西安 710069; 2中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071) 摘要:乙型肝炎病毒(HBV)仍然是全世界面临的对人类危害最大的病原体之一.核苷(酸)类 似物药物可以有效抑制HBV的复 制,目前已成为治疗HBV感染的首选药物.患者长期用药会导致对耐核苷(酸)类似物的HBV 突变体的选择,影响药物的继续使用. 本文参考近年来国内外有关研究进展,对核苷(酸)类似物的作用机制和HBV对其的耐药机 制作一综述. 关键词:HBV;核苷类似物;抑制机制;耐药机制 中图分类号:R978.1文献标识码:A Inhibitorymechanismsofnucleos(t)ideanalogsinHBVreplicationand . drugresistanceonnucleos(t)ideanalogtreatmentofhepatitisB LiShi—xue,LiuJian.1iandHeWei (1SchoolofLifeSciences,NorthwestUniversity,KeyLaboratoryofResourceBiology andBiotechnologyinWesternChina,MinistryofEducation,Xiall710069; 2WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071) ABSTRACTHepatitisBvirusremainsoneofthemostharmfulpathogenstomankindworldwide.Nucle os(t)一 ideanalogsareabletoinhibitthereplicationofHBVefficiently.Theyhavebecometheprimarychoiceinth etreat— mentofchronicHBVinfection.Nevertheless,long?termtherapyofnucleos(t)ideanalogsleadstothesel ectionof drug—resistantmutants.Basedontherecentfindingsinanti-HBVtherapy,thisreviewaimstosummariz etheinhibitory mechanismsofnucleos(t)ideanalogsinHBVreplicationandthedrugresistanceonnucleos(t)ideanalog streatmentof hepatitisB. KEYWORDSHBV;Nucleos(t)ideanalogs;Inhibitorymechanism;Drugresistance 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)是全球范 围内慢性肝炎,肝硬化和肝癌的首要成因n.z】.据世界 卫生组织保守估计,全世界有超过3.5亿人是慢性 HBV的携带者,每年全球至少有100万人死于肝癌 或肝硬化1.在亚洲,HBV带来的社会健康问题尤为 严重.尽管近年来危害人类健康的新生病毒不断出现, 但是HBV仍是全球亟待解决的最棘手问题之一. 目前临床治疗主要是采用Ot一干扰素(IFN—)或核 苷(酸)类似物[nucleos(t)ideanalogs】.最近十多年 来,核苷(酸)类似物药物发展迅速,已成为首要的治疗 选择.因为它们有强大的抑制病毒复制的效果,患者对 药物的耐受性比一干扰素好,但是长期使用会导致对 HBV耐药突变株的选择.因此,HBV对核苷(酸)类似 物的耐药问题可能是人类战胜HBV的过程中不得不 攻克的难关. 1核苷(酸)类似物对HBV复制的抑制机制 研究核苷(酸)类似物的作用机制,首先需要了解 HBVDNA的复制机制.HBV病毒粒子进人细胞后, HBV的松弛环状基因组被修复为共价闭环DNA (covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)occcDNA人 收稿日期:2008—07.07修回日期:2008.10.16 基金项目:国家自然科学基金(No.30070905);陕西省重点实验室基金资助 (N0:03JS008,04JS06). 作者简介:李世学,男,生于1984年,在读硕士研究生.通讯作者,E—mail:jlliu@nwu.edu.cn ? 194?核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制李世学等 核后作为转录模板转录出HBV各种mRNA,其中最长 的一条mRNA,即前基因组RNA逆转录生成子代 HBV松弛环状基因组.其中逆转录过程是核苷(酸)类 似物对HBV复制的抑制靶点.逆转录的简要过程如下 (图1)13,4]:(a)HBV聚合酶首先与前基因组RNA的8一 结构作用,发出衣壳形成信号,HBV核心蛋白组装成 衣壳.核酸复制随后便在核衣壳中进行.8.结构是前 基因组RNA5端的一个RNA二级结构,s一序列同时 是合成复制起始所需的3,4ntDNA引物的模板.引 物第一个核苷酸GTP共价连接在HBV聚合酶末端蛋 白的Tyr96上.合成这个短DNA引物的过程也叫逆转 录的引发(priming);(b)聚合酶一引物复合物移位到 前基因组RNA的3端,引物与DR1区的相应碱基配 对.聚合酶的逆转录酶功能域以前基因组RNA为模板 开始负链DNA的合成;(c)在负链DNA合成过程中, 前基因组RNA被聚合酶的RNaseH活性所降解,仅留 下末端大约18nt作为正链DNA合成的引物;(d—e) 为使基因组环化,正链DNA合成的RNA引物移位到 负链DNA5端与DR2配对,聚合酶在此开始正链的 合成.合成开始时还要经历一次模板转换过程,即从 负链DNA模板的5端跳到3端再继续复制,直到正 链合成结束. 核苷(酸)类似物作用的靶位点是HBV聚合酶的 逆转录酶部分.它们在体内磷酸化后成为三磷酸形 式,作为逆转录酶的自然底物dNTP的类似物(图2), 是逆转录酶的竞争性抑制剂.核苷(酸)类似物与逆转 录酶结合后,通过造成DNA合成提前终止而对HBV 基因组复制发挥强大抑制作用一1.与逆转录酶相比, 宿主细胞的依赖DNA的DNA聚合酶被核苷(酸)类似 TP 物抑制的程度较弱【7】.某些核苷(酸)类似物,如阿德福 韦(adefovir,ADV)还具有一定的免疫调节功能?1. 多数核苷(酸)类似物没有与dNTP3一OH在结 构与功能上对应的一OH,所以它们一旦被逆转录酶添 加到延伸中的DNA链的3末端,后续的dNTP就无法 与之形成磷酸二酯键而连接,往往在合成HBVDNA 第一链即负链的过程中,反应便会提前终止b一1.拉 米夫定(1amivudine,3TC),恩曲他滨(entricitabine, FrI1c),阿德福韦和替诺福韦(tenofovir,TNV)等都属此 类,其中拉米夫定和阿德福韦是最早获得FDA批准使 用的两种抗HBV核苷(酸)类似物. 部分核苷(酸)类似物,如喷昔洛韦(penciclovir, PCV)和恩替卡韦(entecavir,ETV,2005年获得FDA批 准)具有与正常核苷酸3一OH功能上对应的一OH, 它们也有链终止的作用.通过对疱疹病毒的研究显示, 喷昔洛韦加在合成中的DNA链的3末端,可以很低 的速率与下一个核苷酸以磷酸二酯键相连,终止DNA 合成反应】.通过对恩替卡韦抑制HBV复制的研究 发现,与喷昔洛韦不同,恩替卡韦使DNA链的合成反 应在E?TP插入处之后的2,3nt处终止n...产生这 种现象的具体机制有待进一步研究. ADVDP,TNVDP和ETVTP,PCVTP分别是dATP 和dGTP的类似物(ADV,TNV是AMP类似物,本身分 子中已含有一磷酸基),除了在合成负链的过程中掺 人其中使合成提前终止外,还可抑制逆转录的引发.逆 转录引发过程中合成的3—4ntDNA引物中有A和 G,所以在该过程中掺人上述药物可使逆转录在引物 合成时便终止?.4.7.8】. 克拉夫定(clevudine,L-FMAU)比较独特,对负链 ……………… 咎一址,\\ ……………….. 5\3 \ \lDR2(_)_DNA !二:里 DR2 (c) RT:逆转录酶;TP:末端蛋白;DR:直接重复;pgRNA:前基因组RNA 图1HBV复制过程简图 中国抗生素杂志2009年4月第34卷第4期 DNA合成的抑制作用微弱,但对合成第二链,即正链 却有较强的抑制作用[11】,其具体机制尚不明确.第四 个获得FDA批准的抗HBV核苷(酸)类似物——替比 夫定(telbivudine,LdT)是第一个JB.L一核苷类似物,其 对HBV逆转录的抑制机制与克拉夫定相似,主要抑制 第二链的合成,即抑制依赖DNA的DNA聚合酶活 性I. 核苷(酸)类似物主要抑制逆转录过程,对细胞核 中已形成的HBVcccDNA无抑制作用,也不能抑制从 胞外游离的病毒粒子到形成cccDNA的过程【3???H】.但 是使用这些药物降低病毒载量(vimlload)后,有助于 机体免疫系统清除cccDNA【3】. 2HBV对核苷(酸)类似物的耐药性 核苷(酸)类似物作为强有力的抗HBV药物,已 经遇到了HBV耐药性带来的严重挑战.如前所述,目 前的核苷(酸)类似物对细胞核内的cccDNA无效,因 此停药后病毒载量会发生反弹,所以大多数情况下患 …b一 NH l 一 . . 一 . Ho— / PCVTP C核苷类似物(三磷酸形式) NH l? H 『IN— (Po3)3一vo\ l oH ADVDP 者需接受长时间的药物治疗J.然而,长时间用药导致 对耐药突变株的选择.对于第一个获得FDA批准的 HBV治疗药物——拉米夫定,其第1年耐药率为20% 左右,第2,4年耐药率分别上升到40%和70%左右, 已经严重威胁到拉米夫定的长期使用bJ.截至目 前,所有已上市和即将投人使用的核苷(酸)类似物都 发生了程度不等的耐药问题.结构相似,作用机制相同 的药物(如拉米夫定和恩曲他滨)之间还有交叉耐药 性,这令耐药问题雪上加霜.令人稍感安慰的是,第二 个获得FDA批准的抗HBV核苷(酸)类似物——阿德 福韦的耐药问题并不严重,而且和最常用的拉米夫 定之间无交叉耐药性;第三个获批的恩替卡韦的耐 药性似乎也很轻微,但尚需进行更多的长期临床观 察n?.近期报道阿德福韦或恩替卡韦在拉米夫定耐 药基础上进行治疗,产生阿德福韦或恩替卡韦耐药比 率远比未用过拉米夫定治疗的患者多. 一 .. (Po3)3一o oH ETVTP o ll ,NH NH, , . 3TCTP:拉米夫定三磷酸;FTCTP:恩曲他滨三磷酸;PCVTP:喷昔洛韦三磷酸; ETVTP:恩替卡韦三磷酸;ADVOP:阿德福韦三磷酸;TNVOP:替诺福韦三磷酸 图2几种核苷(酸)类似物的结构 ? 196?核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制李世学等 3产生HBV耐药性突变的原因 所有依赖RNA的聚合酶都没有校正功能,即3 -- +5外切酶活性.所以其错配率比依赖DNA的聚合酶 高得多.在HBV的复制周期中,两次使用了依赖RNA 的聚合酶:一是宿主细胞的RNA聚合酶?从cccDNA 转录出前基因组RNA;二是HBV的逆转录酶从前基 因组RNA逆转录合成基因组DNA.所以,HBV虽然是 DNA病毒,但其突变率比其它DNA病毒高得多.HBV 的突变率为10./碱基/复制循环引,对于血清病毒载 量为10挖病毒粒子/ml的患者,HBV的复制率可达 10病毒粒子/天.根据这些理论数据分析,一个患者 体内的HBV每天可发生1000次点突变bl. HBV的基因组很小(3.2kb),其所有ORF都与别 的ORF有重叠晗...所以,1个点突变往往可引起多个 基因产物的变化阻.因此,HBV高突变率产生的大部 分突变体对病毒都是有害的,但仍有一部分是有利突 变,或在某种选择压力下是有利的II.这些不同的突变 株在宿主体内组成了HBV的遗传异质种群,每一个突 变株也称为一个准种(quasi.specie)l. 大多数耐药准种的复制能力都低于野生型,所以 在没有药物选择压力的情况下,耐药准种的含量很 少.但核苷(酸)类似物使用后,耐药的HBV准种很快 就超过其它准种而居于统治地位H,川.停药之后,它 们又会被野生型重新取代. 4HBV对核苷(酸)类似物的耐药机制 4.1HBV的聚合酶 HBV聚合酶包括4个功能域:末端蛋白(参与逆 转录的引发),间隔蛋白(spacerprotein,功能不明),逆 转录酶和RNaseH(图3)D?引.逆转录酶功能域包含 A,G7个结构域.对于HBV聚合酶氨基酸序列的编 号,现在通用的是Stuyver等2001年提出的对4个 功能域分别编号的.以下所有的氨基酸序号均是 采用这种编号方法.HBV逆转录酶C域203—206位 氨基酸组成一个保守的YMDD(Tyr.Met—Asp.Asp)基序 (motif),和其它依赖RNA的聚合酶一样,该YMDD基 序是酶催化活性中心的主要部分H】. 尽管难以纯化HBV聚合酶以获得晶体衍射结构, 但是因为HBV和HIV的逆转录酶有明显的序列同源 性,现在已经有数个研究小组根据HIV聚合酶构建了 HBV聚合酶的三维结构模型115.251.HBV聚合酶也是 “右手构象”,也是由”拇指”(thumb),”掌”(palm)和”手 指”(fingers)_~个亚功能域组成?,15,251.催化活性位点 (YMDD)在”掌”部,”手指”与新加入的dNTP和模板作 用,”拇指”参与模板的定位和链的延伸】.dNTP结合 位点,也称为dNTP结合口袋(dNTP—bindingpocket), 在”掌”和”手指”之间】. 4.2HBV对拉米夫定的耐药机制 在对各种抗HBV核苷(酸)类似物的耐药机制的 研究中,拉米夫定耐药性被研究得最为深人.M204V/I 和L180M是最主要的耐药突变. 逆转录酶C结构域YMDD基序的突变M204V/I 可给HBV带来超过1000倍的高水平耐药[31.这两种 突变会引起聚合酶复制能力的下降?+引.B域V173L 和L180M突变可对YMDD突变造成的复制能力下降 起到一定的补偿作用H?.临床中M204V常与L180M 和/或V173L共同存在,M204I一般单独存在心?27,引. 此外,其它一些已发现的不太常见的耐药突变有: F166L,P177L,L180C,A181T/V,T184S,M204S和 I(G)II(F1AB YMDD 692 (rt344) CDE 拉米夫定/恩曲他滨 阿德福韦 恩替卡韦 Vl73L Ll80M A18lV/T Tl84G M204V/I S202I N236T M250V 图3HBV聚合酶功能域,结构域简图及几种核苷(酸)类似物主要选择的耐药突变 中国抗生素杂志2009年4月第34卷第4期 V207I等??25,29-311o (1)M204V/IYMDD基序M204的突变影响了 dNTP结合口袋容纳拉米夫定的能力【4】. 在HBV分子模型中,新加入的底物dNTP占据了 立体化学上有利的空间定位,M204与新掺人的核苷 酸在空间上接近,YMDD基序面与dNTP表面是互 补的n引.M204突变为V/I204后,氨基酸的口碳原子 被引入甲基而限制了204位氨基酸侧链的伸屈性 (flexibility),该突变在构象上又有利于CB上的一CH, 指向新加入的dNTP的戊糖环,所以M204V/I突变减 小了酶与底物之间的空间u1.HIV一1逆转录酶中相应 的M184I突变的晶体结构显示了类似的空间构象. 作为dCTP类似物的3TCTP与正常底物(dNTP) 相比,L一氧硫戊糖环取代了D.脱氧核糖环(图 2).这两个五元环构型不同,而在逆转录酶的dNTP结 合口袋中,3TCTP,dNTP的三个磷酸基和碱基的定位 是相同的,所以3TCTP的氧硫戊糖环要占据dNTP结 合口袋中额外的一定空间n引.如前所述,M204V/I突 变减小了聚合酶和底物之间的空间,V/I204CB上的 一 CH又指向了底物的糖环,故3TCTP与dNTP相比, 前者受到的空间位阻大于后者,结果是3TCTP进入结 合口袋的难度比dNTP大,产生了HBV对拉米夫定的 耐药性n?副.该机制也适用于其它L.核苷(酸)类似 物,如恩曲他滨n引. 与拉米夫定的五元氧硫戊糖环相比,阿德福韦相 应位置的无环链(图2)具有扭转柔韧性,这一段链长 度也比拉米夫定的氧硫戊糖环要小,所以,突变后变 得”拥挤”了的核苷酸结合位点容纳较小且具柔韧性 的无环核苷类似物(如阿德福韦和替诺福韦)比含氧 硫戊糖环的药物要容易得多n1.换句话说,ADVDP与 突变后的聚合酶之间没有大的空间位阻.这一根据 HBV聚合酶模型得出的推论可以很好的解释实验结 果:M204V/I和L180M双突变对阿德福韦仅有0.9 2.3倍的耐药性D. (2)L180M临床中该突变一般与M204V一同 出现.体外实验结果显示,L180M单突变对逆转录酶 结合含氧硫戊糖环药物影响不大n1. L180侧链占据了F88和M204侧链问的空 间I151.尽管L180的侧链指向新进入的dNTP的糖环, 但它们之间最短距离也有4.5A,这表明二者的相互作 用较弱且较为间接n1.L180M突变引人了一个较长, 但却有更大伸屈性的侧链.更长的侧链会增加酶与L. 核苷(酸)类似物的空问位阻,侧链的柔韧性却能减小 这种空间位阻.所以,L180M对这类药物仅能引起很 小幅的的上升(对拉米夫定,恩曲他滨不超过2.6 倍tls.2s1. L180M突变更重要的作用可能是增强M204V/I 突变株的复制能力,因为实验结果表明LI80M, M204V/I双突变比M204V/I单突变对拉米夫定的 耐药程度更高(L180M+M204I为实验室构造)[41. 可能的解释是L180M突变引起与其空间上靠近的氨 基酸的侧链的重新定位,尤其是F88(位于dNTP结合 口袋中)和V/I204,从而影响结合口袋的构象副. (3)V173LV173与F88直接作用.V173L突变 使F88的芳香环发生旋转,并使其侵入dNTP结合口 袋中,增强了与拉米夫定的空间位阻n1.V173L也会 对M204V/I突变造成的复制能力下降产生补偿作 用??271.HBV逆转录酶分子模型显示V173在复制时 位于模板链下方,且靠近酶的活性位点.因此,V173L 突变导致酶的复制能力增强的原因可能有:?影响模 板链的位置;?影响参与核苷酸聚合过程的其它氨基 酸残基【2. 4.3HBV对阿德福韦的耐药机制 逆转录酶D结构域N236T突变赋予HBV对无环 核苷酸类似物阿德福韦,替诺福韦4—8倍的低水平耐 药性,而对有环的核苷类似物敏感ns.34,”1.分子模型显 示N236并不直接靠近酶的活性位点,但接近$85 (2.98]t),并可能与之形成氢键,$85直接与ADVDP 的.磷酸基作用.发生N236T突变后,236位与85位 之间的氢键会发生变化,这可能间接影响$85与 ADVDP的作用[251.该突变也会导致HBV复制能力的 下降【引. 目前还发现A181T/V突变与阿德福韦耐药性有 关【21.AI8I位于临近dNTP结合位点的一个一螺旋 中,A181T突变使该螺旋发生弯曲,因为T181可以和 P177之间额外又形成一个氢键,可能由此导致核苷酸 结合口袋的构型发生变化.A181T突变对拉米夫定也 有耐药性引.A181V机制尚不明确. 4.4HBV对其它几种核苷酸类似物的耐药机制 (1)恩替卡韦恩替卡韦于2005年成为第三个获 FDA批准的抗HBV药物.目前已经发现的耐药突变 有T184G,$202I和M250V.但是这些突变都来自接受 拉米夫定治疗并产生严重耐药性后转为恩替卡韦治疗 的患者b.近期的研究显示,未接受过核苷类似物治 疗的患者接受恩替卡韦治疗48周后,没有发现耐药 性的产生D引.更长期的耐药性监测仍在进行中. (2)恩曲他滨由于结构上的相似性,与拉米夫定 选择同样的耐药突变株,但是耐药率比拉米夫定低 ? l98?核苷类药物对HBV复制的抑制机制和HBV对核苷类药物的耐药机制李世学等 (?,?期试验显示:第一年9%;第二年18%)[391. (3)替比夫定也选择M204I突变,第一年耐药 率<10%131. (4)克拉夫定实验数据表明耐拉米夫定的HBV 和土拨鼠肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus,WHV) 也对克拉夫定耐药,反之亦然u...尽管这两种药物 的结构和作用机制都不相同,但它们很可能选择相同 的耐药突变. (5)喷昔洛韦主要的机制是选择耐药突变 L180M和M207It25,41】. 5结语 核苷(酸)类似物是一类有效的抗HBV药物,在一 定时期内它们仍将是治疗HBV感染的首选.随着人 们对抗ItBV核苷(酸)类药在临床应用中产生耐药性 的机制和规律的深入了解,或许可以通过监测不同患 者的HBV基因型和表型来制定独特的抗病毒治疗方 案,从而更好地发挥核苷(酸)类药的抗HBV治疗作 用.但是,要从根本上解决耐药性问题,恐怕还有待于 研发针对新的抗HBV靶点,特别是以宿主细胞的功能 蛋白为靶点的抗HBV新药. 参考文献 【1】GanemD,PrinceAM.HepatitisBvirusinfection.natural historyandclinicalconsequences【J1.NEnglJMed,2004, 350(11):1118,1129. 【2】WorldHealthOrganization.HepatitisB【EB/OL】.(2000—10) 【3】ZoulimF.Mechanismofviralpersistenceandresistanceto nucleosideandnucleotideanalogsinchronichepatitisBvirus infection[J】.AntiviralRes,2004,64(1):115. 【41KarayiannisP.HepatitisBvirus:old,newandfuture approachestoantiviraltreatment[J】.JAntimicrobChemother, 2003.51(4):761,785. f5】DelaneyWE,LocaruiniS,ShawT.ResistanceofhepatitisB virustoantivimldrugs:currentaspectsanddirectionsforfuture investigation[J】.AntivirChemChemother,2001,12(1):1— 35. 【61CalioR,VillaniN,BalestraE,eta1.Enhancementofnatural killeractivityandinterferoninductionbydifferentacyclicnn- cleosidephosphonates[J].AntiviralRes,1994,23(1):77, 89. 【7】ZoulimF.AntiviraltherapyofchronichepatitisB:Callwe clearthevirusandpreventdrugresistance【J】.AntivirChem Chemother,2004,15(6):299—305. f8】ZoulimF.Combinationofnucleosideanaloguesinthetreat- mentofchronichepatitisBvirusinfection:lessonfromexperi- mentalmodels[J】.JAntimicrobChemother,2005,55(5): 608—6l1. 【9】EarnshawDL,BaconTH,DarlisonSJ,eta1.Modeof antiviralactionofpenciclovirinMRC??5cellsinfectedwith herpessimplexvirustype1(HSV-1),HSV-2,andvaricclla- zostervirus[J】.AntimicrobAgentsChemother,1992.36(12): 2747,2757. 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