毕业论文-桂枝甘草汤方药半仿生提取等4种方法提取液的成分比较

毕业论文-桂枝甘草汤方药半仿生提取等4种方法提取液的成分比较 桂枝甘草汤方药半仿生提取等4种方法提取液的成分比较 目的优选桂枝甘草汤方药成分的提取工艺。方法以甘草次酸、肉 桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量为指标,在药材粒度、溶剂量、煎提温度、 滤过、浓缩等条件相同的前提下,采用半仿生提取法(SBE法)、水提取法(WE法)、半仿生提取醇沉法(SBAE法)、水提取醇沉法(WAE法)进行比较研究。结果5个指标综合Y值为:SBE法＞WE法＞SBAE法＞WAE法。结论 桂枝甘草汤方药成分的提取以用SBE法为佳。即3次煎提用水的pH值依次为：2.00，7.20，8.50，煎煮的时间依次为190，90，50 min。 桂枝甘草汤 半仿生提取法 综合指标 Abstract：ObjectiveThe extraction technologies for the components of Guizhi Gancao Decoction were optimized.MethodsFour methods: the semi -bionicextraction(SBE), the water extraction(WE), the semi- bionicextraction by precipitation with alcohol(SBAE) and the water extraction by precipitation with alcohol(WAE) were used to extract Guizhi Gancao Decoction,with glycyrrhetinic acid，cinnamic acid，total flavones，volatile oil and dry extract taken as the marker,under the same conditions of druggranularity, solventamount, decocting temperature, filtration, concentration, etc., and then four methods were compared and studied.Results Through the comprehensive evaluation of seven markers, their comprehensive values Y decreased in the order of SBE, WE, SBAE and WAE. ConclusionSBE is better than the other three methods in the extraction of the components of Guizhi Gancao Decoction, which is shown by the fact that the pH values of the water for the 1st, 2nd and 3rd decoctions are 2.00，7.20，8.50 and the extraction times are 190，90 min and 50 min respectively. Key words： Guizhi Gancao Decoction； SBE method； Comprehensive index 桂枝甘草汤由桂枝、炙甘草组成。具有补心助阳、升阳化气、补阳 扶中的作用。根据SBE法理论［1～6］，在用均匀优选出桂枝甘草汤方药 SBE法工艺条件和醇沉较佳浓度的基础上［7，8］，为进一步探讨该方药用SBE法提取是否较目前普遍适用的提取方法为佳,故以甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、 挥发油、干浸膏得率为指标,对该方药做了4种提取方法的平行对照实验。 型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；760双光束紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；MA110型电子天平(上海第二分析仪器厂)；型离心沉淀机(上海第三分析仪器厂) ；754紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；vp高效液相色谱仪 (SHIMADZU CORPORATION ASSEMBLED IN CHINA)，检测器，泵； 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；型旋转蒸发器（上海亚荣 生化仪器厂）。 药材经张兆旺鉴定，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝，甘草为豆科植物甘草GLycyrrhiza uraLensis Fisch的干燥根及根茎，炙甘草：取炼蜜，加适量冷开水稀释后，淋入净甘草 片中拌匀，闷润，置炒制容器内，用文火加热，炒至老黄色，不粘手时取出， 晾凉。（甘草片每100 kg，用炼蜜25 kg）。 甘草次酸、肉桂酸、柚皮 苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）批号分别为723-200109，0786-9802，722-200107；甲醇（色谱纯）；重蒸馏水，其余试剂均为A，R。 2.1 提取液的制备 2.1.1 SBE液将处方药材分别粉碎，按处方比例(桂枝：甘草=2?1)称取药 材10～20目粗粉120 g，采用桂枝与甘草混煎的方式，用SBE法工艺条件分别提取3次(双提法；第1煎用水用0.1 mol? L-1HCl调至pH为2.00，第2、3煎用水用0.1 mol?L-1NaOH调至pH为7.20，8.50；加水量依次为药材重量的 10，8，8倍；煎煮时间依次为190，90，50 min；双提法提取的挥发油另器保 存)，分别滤过，离心，合并上清液，水浴浓缩至400 ml（每毫升相当于原药材0.3 g）。 2.1.2 SBAE液取SBE液100 ml，加入95%的乙醇调至醇浓度为70%，冷藏放置24 h，离心，上清液回收乙醇至无醇味后，分别用蒸馏水定容至100 ml（每毫升相当于原药材0.3 g）。 2.1.3 WE液按“2.1.1”项下方法，只改用中性水作为3煎用水，依法制得（每毫升相当于原药材0.3 g）。 2.1.4 WAE液取WE液100 ml，按“2.1.2”项下方法，依法制得（每毫升 相当于原药材0.3 g）。 2.2 供试液的制备精取“2.1”项下提取液各10 ml，加水35 ml，缓缓加入盐酸4 ml，静置30 min， 待气泡消失后加盐酸1 ml，加氯仿30 ml，水浴加热回流1.5 h，放冷，移至分液漏斗中，静置，分取氯仿层（下层），水层 用氯仿萃取2次，20 ml/次，合并氯仿液，回收至干，用无水乙醇定容至25 ml，即得供试液A（每毫升相当于原药材0.12 g）。 精取“2.1”项下提取液各15 ml，置于蒸发皿中，拌硅藻土4 g，混匀，水浴蒸至近干， 105?烘干，研匀，加入醋酸乙酯40 ml，超声提取20 min，滤过，回收醋酸乙酯，残 渣用甲醇定容至5 ml，即得供试液B（每毫升相当于原药材0.9 g）。 取“2.1”项下提取液各25 ml，置于蒸发皿中，拌硅藻土4 g，混匀，水浴蒸至近干，105?烘干，研匀，用甲醇100 ml索氏回流提取5 h（至无色），补足损失重量，滤过，用甲醇定容至100 ml，即得供试液C（每毫升相当于原药材 0.075 g）。 精取“2.1”项下提取液各15 ml，分别置蒸发皿中，加硅藻 土4 g，拌匀，水浴蒸至近干，105?烘干，研细，用50%乙醇40 ml超声提取30 min，滤过，定容至100 ml，得供试液D(每毫升相当于原药材0.045 g)。 2.3 HPLC指纹图谱定性比较 2.3.1 色谱条件色谱柱Phenomenex，(5 μm，4.6 mm×150 mm )；检测波 长254 nm；柱温：室温；灵敏度：1.0AUFS；流动相：甲醇-0.1%磷酸水，甲醇 (5%～28%)：0～4 min?甲醇（28～52%）：4～15 min? 甲醇（52%～84%）：15～25 min ?甲醇（84～100%）：25～45 min；流速：1 ml?min-1；进样量20 μl。 2.3.2 HPLC指纹图谱的比较取供试液D分别进样，进行色谱分析，对样品 各主要特征峰进行比较，结果见图1～5及表1。 确定检测波长为244 nm，见图6。表1 4种方法提取液HPLC指纹图谱色谱峰积分值峰位 保留时间（略） 2.4 甘草次酸的含量测定 2.4.1 检测波长的选择精密称取甘草次酸对照品3.5 mg，加无水乙醇溶解并定容至10 ml，摇匀，以溶剂为空白对照，用760双光束紫外可见分光光度 计在波长200～ 400 nm范围内扫描，结果甘草次酸在244 nm处有最大吸收，故 2.4.2 色谱分析条件色谱柱Phenomenex，(5 μm，4.6 mm×150 mm )；检 测波长244 nm；灵敏度 1.0AUFS；柱温：室温；流动相：甲醇-0.1%磷酸水(87?13)；流速：1 ml?min-1；进样量20 μl。 2.4.3 线性关系考察 精取2.4.1项下甘草次酸对照品甲醇溶液（0.35 mg?ml-1）100，200，400，600，800 μl，加无水乙醇分别定容至1 ml，各取20 μl进样，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，求回归方程，结果 甘草次酸在0.7～5.6μg范围内，其进样量(μg)与峰面积呈良好线性关系，回 归方程Y=1008 434X+104 180， r=0.999 2。见表2及图7。表2 甘草次酸曲线测定值（略） 2.4.4 精密度实验 精取同一浓度对照品液20 μl，连续重复进样5次。结果见表3。表3 精密度实验结果（略） 2.4.5 稳定性实验取供试液A1在室温下自然放置，每隔2 h测定1次峰面积，连续测定6次，结果供试液在12 h内稳定，结果见表4。表4 稳定性实验结果（略） 2.4.6 提取液中甘草次酸含量测定取“2.2”项下供试液A1～4，用0.45 μm微孔滤膜（有机系）滤过，精取滤液各20 μl进样，结果见图8。 2.4.7 加样回收率实验精取已知含量的A6号提取液3.92 ml（5份），分别加入对照品溶液2 ml(0.35 mg? ml-1)，按“2.2”项下制备供试液A的制备方法制备，按 2.4.6项方法测定，计算回收率。结果见表5。 2.5 肉桂酸的含量测定 2.5.1 色谱分析条件色谱柱Phenomenex(5 μm，4.6 mm×150 mm )；检测 波长266 nm；柱温：室温；灵敏度：1.0AUFS；流动相：甲醇-0.1%磷酸水（53?47）；流速：1.00 ml?min-1；进样量：20μl。在上述色谱条件下，肉 桂酸与其它成分均达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数2 778。 2.5.2 对照液的制备 精密称肉桂酸取对照品2.2 mg，加甲醇定容至10 ml。 2.5.3 标准曲线的制备 取肉桂酸对照品溶液（0.22 mg?ml-1）50，100，200，400，800 μl，加甲醇分别定容至1 ml，各取20 μl进样，测定峰面积，以进样量为横坐标， 峰面积积分值为纵坐标，求回归方程，结果肉桂酸在0.22～3.52 μg范围内，其进样量(μg)与峰面积呈良好线性关系，回归方程为Y=7 467 738.5X+123 315.29，r=0.999 8。表5 甘草次酸的加样回收率实验（略） 2.5.4 含量测定取“2.2”项下供试液B1～4，用0.45 μm微孔滤膜滤过,取滤液各20 μl进样，结果见表6。 2.6 总黄酮的含量测定 2.6.1 对照液的制备精密称取柚皮苷对照品3.2 mg，加甲醇溶解定容至10 ml。 2.6.2 标准曲线的制备精取柚皮苷对照品溶液（0.32 mg?ml-1）20，40，80，100，120 μl，加入甲醇1 ml，再加入10% KOH 0.5 ml，室温放置5 min，用甲醇定容至10 ml，另取同量柚皮苷对照液，直接用甲醇稀释至10 ml，作为空白对照液，用754紫外可见分光光度计，在412 nm处测其吸收度，以对照品 量（μg）为横坐标，吸收度为纵坐标，作曲线图，求回归方程，结果柚皮苷在 22～132 μg范围内，其对照品的量(μg)与吸收度呈良好线性关系，回归方程 为Y=5.215×10-3X-0.019 4，r=0.996 4。 2.6.3 含量测定精取2.2项下供试液C1～4 0.5 ml，加入甲醇0.5 ml，再加入10% KOH 0.5 ml，室温放置5 min，用甲醇定容至10 ml，再取上述样品液C1～9 0.5 ml，直接用甲醇稀释至10 ml，作为空白对照液，用754紫外可见分光光度计，在412 nm处测其吸收度。结果见表6。 2.7 挥发油的含量测定 2.8 干浸膏的含量测定精取2.1项下提取液各10 ml（3份），分别置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，烘至恒重，计算干浸膏得率。结果见表6。表6 4种提取方法提取液中各指标成分的含量提取（略） 2.9 综合评判方法与结果将所得数据按Xi；j?(Xi;j？j)/Sj进行标准化处理。Xj为验证实验样品液i中成分j的含量，分别为9个水平样品液中成分j的平均值和标准差，Xi；j 为标准化后的值。根据各指标在提取工艺中的 主次地位，给予不同的加权系数，Xi；j 以标准化后的值 加权求和，即得综合 评价Y值。结果见表7及图9。表7 4种方法提取液中各指标成分含量的标准 化值及综合评价值（略） 4种提取液中甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏得率5个指标综合评判Y值的大小顺序为:SBE液>WE液>SBAE液>WAE液,提示本制剂的方药提 取用SBE法为佳。SBE法符合口服药物经人体胃肠道转运吸收的原理,且有效成分含量高,生产成本低。若欲再减少服用量,进一步去除杂质,可采用SBAE法,其较WAE法提取的成分含量高。 以甘草次酸等2个已知有效成分为指标,同时以总黄酮、挥发油、浸膏得率 为指标,综合选择提取工艺。这样做体现了中药方剂药效物质提取中,坚持“有 成分论,不唯成分论”,发挥活性混合物综合作用特点的“SBE法”观点。同时 也有利于用单体成分控制制剂的质量。除另有规定外,一般说来,在相同的滤过、精制条件下,若得到的总固体物或干浸膏量大,从中医药角度应视为较佳,这也是《中国药典》规定测浸出物的意义所在。 实验结果是根据“SBE法”理论确定各个指标的加权系数及Y的关系式。Y = （甘草次酸+肉桂酸+总黄酮+挥发油）×7＋干浸膏×4。针对各个指标的单位 和量纲不同先对其进行标准化处理,然后根据各指标在工艺选择中的主次,确定不同的加权系数。以标准化处理加权求和后的Y值为综合指标,优选“SBE法”最佳条件,这样比各个指标成分含量直接相加更科学合理。 ［1］张兆旺，孙秀梅．试论“半仿生提取法”制备中药口 服制剂［J］.中国中药杂志,1995,20(11):670． ［2］Zhang Zhaowang,Sun Xiumei．Oral Preparations of Chinese materiamedicabysemi- bionicextraction［J］.ChemicalAbstractsVol，1996：124． ［3］张瑞亭，张兆旺，孙秀梅．思维方式的转换与中药“半仿生提取法”［J］.中国中药杂志,1997,22(9)：542，544． ［4］张兆旺，孙秀梅．“半仿生提取法” 是中药药剂现代化的科学途径［J］.中国中医药报,2000-5-8(4)． ［5］张兆旺，孙秀梅．“半仿生提取法”的特点与应用［J］.世界科学技术 中药现代化,2000,2(1):35． ［6］张兆旺，孙秀梅．中药方剂药效物质提取新技术 “半仿生提取模式”的初探［J］.世界科学技术中药现代化,2000,2(5)：510． ［7］王英姿，孙秀梅，张兆旺．复壮胶囊方药SBE液醇沉浓度的优选［D］.济南：山东中医药大学，1995． ［8］刘训红．中药材薄层色谱鉴 别，第1版［M］.天津：天津科学技术出版社,1990：197．