鲜河豚鱼中河豚毒素的测定标准(理化)修订稿

鲜河豚鱼中河豚毒素的测定标准(理化)修订稿 中华人民共和国国家标准 GB xxxx—xxxx 食品安全国家标准 鲜河豚鱼中河豚毒素的测定(理化方法) National food safety standard Determination of tetrodotoxin in fresh pufferfish xxxx-xx-xx发布 xxxx-xx-xx实施 中华人民共和国卫生部发布 GB xxxx—xxxx 前 言 本标准代替GB/T5009.206-2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》。 本标准与GB/T5009.206-2007相比，主要变化如下: ——增加了对规范性引用文件的说明; ——修改了试剂和材料; ——修改了仪器和设备; ——修改了分析步骤; ——修改了分析结果的表述。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: ——GB /T5009.206-2007; I GB xxxx—xxxx 食品安全国家标准 鲜河豚鱼中河豚毒素的测定(理化方法) 1. 范围 本标准了鲜河豚鱼中河豚毒素(tetrodotoxin，简写为TTX)的测定方法。 本标准适用于鲜河豚鱼中TTX的测定。 2. 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3. 原理 样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入底物后显色，与标准曲线比较来测定TTX含量。 4. 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级以上水。 4.1. 试剂 4.1.1. 辣根过氧化物酶标记的抗河豚毒素单克隆抗体:杂交瘤技术生产并经纯化的抗TTX单克隆抗 体，用辣根过氧化物酶(HRP)标记，(-80?保存，冷冻干燥后的酶标抗体可-20?保存)。 4.1.2. 人工抗原:TTX-载体蛋白连接物。(-80?保存，冷冻干燥后的酶标抗体可-20?保存) 4.1.3. 河豚毒素标准品(CHNO):纯度?98%。(2~8?保存) 111728 4.1.4. 乙酸(CHCOOH)。 3 4.1.5. 乙酸钠(CHCOONa)。 3 4.1.6. 乙醚(CHOCH)。 33 4.1.7. 氢氧化钠(NaOH)。 4.1.8. 磷酸二氢钾(KHPO)。 24 4.1.9. 磷酸氢二钠(NaHPO?12HO)。 242 4.1.10. 氯化钠(NaCl)。 4.1.11. 氯化钾(KCl)。 4.1.12. 碳酸钠(NaCO)。 23 4.1.13. 碳酸氢钠(NaHCO)。 3 4.1.14. 牛血清白蛋白(BSA):纯度?98%。 4.1.15. 吐温-20(Tween-20)。 1 GB xxxx—xxxx 4.1.16. 柠檬酸(CHO?HO)。 6872 4.1.17. 3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺(TMB)。 4.1.18. N，N-二甲基甲酰胺。 4.1.19. 过氧化氢(HO)。 22 4.1.20. 硫酸(HSO):浓度98%。 24 4.2. 溶液配制 4.2.1. 乙酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH4.0) 4.2.1.1. 0.2mol/L乙酸钠溶液:称取乙酸钠16.4g，加水溶解并定容至1000mL; 4.2.1.2. 0.2mol/L乙酸溶液:称取乙酸11.4g，用水定容至1000mL; 4.2.1.3. 0.2mol/L，pH4.0乙酸盐缓冲液:取0.2mol/L乙酸钠溶液2.0mL、0.2mol/L乙酸溶液8.0mL， 二者混合而成。 4.2.2. 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01mol/L，pH7.4) 分别称取KHPO0.2g、NaHPO?12HO 2.9g、NaCl 8.0g、KCl 0.2g，，加水溶解并定容至1000mL。 24 242 4.2.3. TTX标准溶液 4.2.3.1. TTX贮备液(1.0mg/mL):精确称取TTX标准品，用乙酸盐缓冲液定容至TTX浓度为 1.0mg /mL。(2~8?保存) 4.2.3.2. TTX中间液(5µg/mL):用乙酸盐缓冲液将0.5mLTTX贮备液定容至100mL。(2~8?保存) 4.2.3.3. TTX标准曲线工作液:分别吸取TTX中间液0.005mL、0..01mL于500mL容量瓶中，用 0.01mol/L，pH7.4 PBS定容至刻度;分别吸取TTX中间液0.01mL、0.02mL、0.1mL、0.2m1、 0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL、50.0mL于100mL容量瓶中，用0.01mol/L， pH7.4 PBS定容至刻度;工作曲线工作液的浓度从低到高依次为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、 10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00、1000.00、2500.00、5000.00ng/mL。(2~8? 保存) 4.2.4. 乙酸溶液(0.1%):取1mL乙酸，加水定容至1000mL。 4.2.5. 氢氧化钠溶液(1mol/L):称取氢氧化钠(NaOH)40g，加水溶解并定容至1000mL。 4.2.6. 包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液) 分别称取NaCO1.59g、NaHCO2.93g，加水溶解并定容至1000mL。 233 4.2.7. 封闭液 2 GB xxxx—xxxx 称取BSA2.0g，加PBS溶解并定容至1000mL。(2~8?保存) 4.2.8. 抗体稀释液 称取BSA1.0g，加PBS溶解并定容至1000mL。(2~8?保存) 4.2.9. 磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)(0.01mol/L，pH7.4) 取0.5mL吐温-20，加PBS溶解并定容至1000mL。 4.2.10. 底物缓冲液 4.2.10.1. 柠檬酸溶液(0.1mol/L):称取柠檬酸21.01g，加水溶解并定容至1000mL。 4.2.10.2. 磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L):称取NaHPO?12HO 71.6g，加水溶解并定容至1000mL。 242 4.2.10.3. 底物缓冲液:取柠檬酸溶液24.3mL、磷酸氢二钠溶液25.7mL，加水定容至100mL。 4.2.11. 底物溶液 4.2.11.1. TMB储存液:称取0.2gTMB，加N, N-二甲基甲酰胺溶解并定容至20mL;(2~8?避光保存) 4.2.11.2. 取75µLTMB储存液、10mL底物缓冲液和10µLHO混合而成，现用现配。 22 4.2.12. 终止液(2mol/L硫酸溶液) 取891.5mL 98%的浓硫酸，缓慢加至盛有108.5mL水的玻璃容器中。 4.3. 材料 4.3.1. 酶标微孔板:平底。 5. 仪器和设备 5.1. 电子天平:感量分别为0.01g、0.0001g。 5.2. 离心机:转速?8000 转/分钟。 5.3. 酶标仪(可测定450nm吸收波长)。 5.4. 恒温培养箱:37?1?。 6. 分析步骤 6.1. 试样制备 6.1.1. 样品采集及运输 现场采集样品后立即4?冷藏，并于当天运至实验室进行检验。如果路途遥远，可于当天进行冷冻，并应保存在冷冻状态中运输至检验实验室。 6.1.2. 取样 3 GB xxxx—xxxx 对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后，用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢(雄性为精囊)等部分，各部分组织分别用水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重。 6.1.3. 样品提取 6.1.3.1. 将待测河豚样品组织用剪刀剪碎，加入5倍体积0.1%的乙酸溶液(即1g组织中加入0.1%的 乙酸溶液5mL)后，磨成均匀糊状。 6.1.3.2. 取25mL样品糊(相当于5g河豚组织)于烧杯中，置温控磁力搅拌器上边加热边搅拌，达 100?时持续10min后取下，冷却至室温后，8000r/min离心15min，快速过滤于125mL分液 漏斗中。 6.1.3.3. 滤纸残渣用20mL 0.1%的乙酸溶液分次洗净，洗液合并于原烧杯中，置温控磁力搅拌器上边 加热边搅拌，达100?时持续3min后取下，8000r/min离心15min过滤，滤液合并于6.1.3.2 分液漏斗中。 6.1.3.4. 在6.1.3.2分液漏斗的清液中加入等体积乙醚振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏 斗中，并用等体积乙醚再重复脱脂一次，将水层放入100mL锥形瓶中，去除其中残存的乙醚 后，将提取液移入50mL容量瓶中。 6.1.3.5. 将6.1.3.4的提取液用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.0，并用PBS定容至50mL，立即 用于，该液每毫升相当于0.1g河豚组织样品。 6.1.3.6. 当天不能检测的提取液去除残存的乙醚后不用调pH，密封后-20?以下冷冻保存，在检测前 调节pH并定容至50mL立即检测。 6.2. 样品测定 6.2.1. 包被酶标微孔板 用TTX-载体连接物包被酶标板，120µL/孔，4?静置12h。 6.2.2. 抗体抗原反应 将辣根过氧化物酶标记的抗TTX单克隆抗体稀释后分别: 6.2.2.1. 与等体积不同浓度的河豚毒素标准溶液在2mL试管内混合后，4?静置12h或37?温育2h 备用。此液用于制作TTX标准抑制曲线。 6.2.2.2. 与等体积样品提取液在2mL试管内混合后，4?静置12h或37?温育2h备用。此液用于测 定样品中TTX含量。 6.2.3. 封闭 4 GB xxxx—xxxx 已包被的酶标板用PBS-T洗3次(每次浸泡3min)后，加封闭液封闭，200µL/孔，置37?温育2h。 6.2.4. 测定 封闭后的酶标板用PBS-T洗3×3min后，加抗原抗体反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液代替抗体作为空白对照，加PBS代替河豚毒素标准溶液作为阴性对照)，100µL/孔，置37?温育2h，酶标板洗5×3min后，加新配制的底物溶液，100µL/孔，37?温育10min后，加入终止液终止显色反应，50µL/孔，于波长450nm处测定吸光度值。 6.3. 标准曲线的制作 以标准溶液OD值与阴性对照OD值的比值为纵坐标(即标准品OD比)，所对应标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标，制作标准曲线。 6.4. 试样溶液的测定 根据样品OD值与阴性对照OD值的比值(即样品OD比)，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为测定液中TTX浓度的对数值，求得反对数即为测定液中TTX浓度C(ng/mL)，平行测定次数不少于两次。 7. 分析结果的表述 试样中TTX的含量按公式(1)计算: C，D，VX, ……………………………………(1) m 式中: X——试样中TTX的含量，单位为微克/千克(,g/kg); C ——试样测定液中TTX浓度，单位为纳克/毫升(ng/mL); D ——样品提取液的稀释倍数; V ——样品提取液定容体积，单位为毫升(mL); 样品质量，单位为克(g)。 m —— 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。 8. 其他 检出限为0.1µg/L，相当于样品中1µg/kg的TTX。(本方法线型范围为5µg/L~500µg/L)。 5