【最新2014-2015】多重等位基因PCR技术对中国人5种常见β-医学论文

【最新2014-2015】多重等位基因PCR技术对中国人5种常见β-医学论文 多重等位基因PCR技术对中国人5种常见β 【摘要】 目的 对中国人常见的CD71-72、CD41-42、CD17?0、 IVS-?-654C?T和-28A?G等5种β-地中海贫血突变类型进行多 重等位基因特异性PCR,MASPCR,技术检测，以证实该方法的可 靠性和准确性。方法 利用针对野生型及突变性β-珠蛋白等位基因的 特异引物，应用单管MASPCR技术对我国常见的5种β-地中海贫 血点突变类型进行产前分子检测。结果 在被检测的8个家庭共24 例受试者中，有17例表现为携带至少一种突变类型的杂合子。其中 胎儿有1例为β-地中海贫血双重杂合子，5例为杂合子，2例正常。 经分娩或流产后基因分析验证，所有结果均与产前诊断一致。结论 MASPCR技术适合于检测β-地中海贫血已知点突变类型，是一种简 便、可靠、经济的产前基因诊断方法，具有广阔的优生科学应用前景。 【关键词】 地中海贫血 产前诊断 聚合酶链式反应 ,ABSTRACT,ObjectiveTo detect five common types of β-thalassemia mutations ,(CD71-72(+A), CD41-42(-4bp), CD17?0, IVS-?-654C?T and-28A?G), in the Chinese by using multiplex allele-specific PCR (MASPCR) and assess the reliability of this new technique. MethodsAiming directly at wild types and mutation types of β-globin alleles, MASPCR was performed in a single tube to make a prenatal detection of the common five kinds of point mutations of β-thalassemia.ResultsSeventeen cases in 24 of eight families 更多精品文档,欢迎来我主页查询 were heterozygoted with at least one mutation allele. Among the fetus, one was double heterozygotes of β-thalassemia mutations, five single heterozygotes, and two normal. All were confirmed later by gene analysis after delivery or abortion, which coincided with the prenatal diagnosis. ConclusionThis testing method can be used for detection of characterized point mutations in β-thalassemia, which is convenient, reliable and economical for prenatal gene diagnosis of β-thalassemia with a broad prospect in aristogenesis. ,KEY WORDS,Thalassemia; Prenatal diagnosis; Polymerase chain reaction β-地中海贫血是一种遗传性血液病，其病因是由于β-珠蛋白基因 不同类型的点突变引起β-珠蛋白链合成减少,β+,或缺失,β0,， 因而过剩的α链与红细胞膜结合最终引起溶血性贫血。该病在世界范 围内均有报道，几乎见于所有人群和种族，在我国南方省份β-地中 海贫血亦有较高的发病率,1,。β-地中海贫血的分子缺陷具有高度异 质性，主要表现为个别碱基的缺失、插入或臵换，迄今世界范围已发 现180多种突变类型，国内也发现了20多种突变类型,2,3,。由于 该病的临床后果严重，因此对夫妇进行产前诊断以避免病儿出生以及 对病儿进行早期诊断和治疗具有重要意义。本研究针对中国人中发病 率较高的5种β-地中海贫血突变类型:CD71-72,+A,、CD41-42 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,-4 bp,、CD17?0、IVS-?-654C?T和-28A?G和合成5组扩增引物，应用单管多重等位基因特异性PCR(MASPCR)技术对24例β-地中海贫血病儿或携带者进行基因诊断。现将结果如下。 1 资料和方法 1.1 病例选择 共检测了8个家庭24例受试者，在来自父母的样本中，夫妇年龄26:37岁，并且经血液学及血红蛋白检查双方至少有一人确诊为β-地中海贫血，全部受试者均来自青岛大学医学院附属医院,5例正常对照为门诊健康查体者，无β-地中海贫血病史。按照知情同意原则，8个家庭均自愿进行产前诊断。 1.2 方法 1.2.1 样本采集及DNA提取 按文献,2,所述方法，采集羊水样本或外周静脉血，血液标本经ACD抗凝，-80 ?保存。取10 mL羊水或1 mL血液样本，采用常规苯酚-氯仿-异戊醇法(25?24?1)抽提DNA，随后用乙醇进行沉淀，将所得DNA溶解于TE(1 mmol/L EDTA Tris-HCl,pH 8.0)，终浓度为200 mg/L。 1.2.2 引物设计和合成 应用DNA Star软件设计MASPCR引物，引物由上海生物技术公司进行引物合成，所有引物3′端针对正常与突变等位基因的碱基均以黑斜体字母标出，其产物长度见表1。 1.2.3 PCR扩增方法 每个DNA标本分别用5对C/N和C/M引物于两个eppendorf管中进行MASPCR，一管为C/N配对检测正常等位基因，另一管为C/M配对检测突变等位基因。PCR反应体系更多精品文档,欢迎来我主页查询 为25 μL，含有PCR缓冲液,10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3, 50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,1 g/L Gelatin,，DNA 200 ng，每种引物0.4:1.6 μmol/L,每种dNTP 250 μmol/L，40: 1.0:1.5 U的Taq DNA聚合酶,TAKARA公司产品,。MASPCR 60 ? 45 s，72 ? 45 s，重复循环30循环参数为94 ? 1 min， 次后，最后于72 ?再延伸8 min,PCR产物10 μL在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色后在紫外线检测仪,Eagle eye?,上观察并照相记录结果。 2 结 果 应用MASPCR方法，我们对来自8个家庭的共24例标本进行了产前基因诊断， 17例为β-地中海贫血基因突变杂合子。在8对夫妇中，有11例为β-地中海贫血一个位点的杂合性突变，5例为正常。在所检的8例胎儿中，1例为β-地中海贫血双重杂合子突变型，5例为单一位点的杂合子突变型，2例为正常。所有结果均在分娩或流产后进行了确认，结果与产前基因诊断完全一致。所用样本的等位基因类型见表2。 正常对照样本的DNA样品经5对C/N引物进行MASPCR后，除了产生一条由共用引物C1和C2配对产生的1 434 bp恒定扩增带外,可作为PCR扩增的内对照,，还产生5条分别对应于CD71-72,+A,、CD41-42,-4 bp,、CD17?0、IVS-?-654C?T和-28A?G突变的543、463、250、177和121 bp的正常扩增带(图1, 泳道?N)，而经5对C/M引物扩增后，仅产生一条1 434 bp的恒定扩更多精品文档,欢迎来我主页查询 增带(图1, 泳道?M)，说明正常对照样品不含这5种β-地中海贫血突变。胎儿1及其母亲的DNA样品经5对C/N引物扩增后，出现 ?N、?N)，与正常了5条正常扩增带及一条恒定扩增带(图1,泳道 对照不同的是，经5对C/M引物扩增后，除了一条恒定扩增带外，还有一条相应于CD17?0突变的463 bp条带(图1,泳道?M、?M)。由此可知，病儿1及其母亲为CD17?0杂合子，而其父亲的两条等位基因均正常(图1, 泳道?N、?M)。同样，胎儿2及其父亲均为IVS-?-654C?T突变型杂合子(图1, 泳道?N、?M及?N、?M)，而其母亲两条β-珠蛋白等位基因均正常(图1, 泳道?N、?M)。表1 用于检测β-地中海贫血基因的MASPCR寡核苷酸引物注:N为正常引物序列，3′端碱基对应于正常DNA序列,M为突变引物序列，3′端碱基对应于突变DNA序列,C1为上游通用引物，与N(1-4)或M (1-4)配对使用,C2为下游通用引物 表2 8个家庭β-地中海贫血产前基因诊断结果 注:-28为-28A?G突变类型，17?0为CD17?0突变类型，41-42为CD41-42(-4 bp) 突变类型，71-72为CD71-72(+A) 突变类型，654为IVS-?-654C?T突变类型，βA为正常β珠蛋白等位基因 图1 应用MASPCR进行β-地中海贫血基因诊断的电泳结果 L: DNA Ladder, N:5对C/N引物的MASPCR产物,M:5对C/M引物的MASPCR产物,?正常对照,?、?、?家庭1的MASPCR结果，数字?、?、?分别代表胎儿、母亲、父亲。?、?、?家庭2的MASPCR结果，数字?、?、?分别代表胎儿、母更多精品文档,欢迎来我主页查询 亲、父亲 3 讨 论 据WHO统计，全球约有超过1亿人携带地中海贫血基因，每年出生的各类重症地中海贫血病儿至少有20万，该病在我国的高发区主要分布在长江以南地区,4,5,。β-地中海贫血是一种β-珠蛋白合成减少或缺乏的遗传性血液病，严重影响病儿的生活质量,6,。由于目前对该病尚无有效的治疗方法，因此，早期、快速、准确地诊断β-地中海贫血对预防和进一步治疗具有重要意义,7,。尽管在我国已发现20余种β-地中海贫血突变类型，但以5种突变类型最为常见，约占到中国人群的80,,8,。因此，本研究中所用方法适用于我国大多数人群β-地中海贫血的基因诊断。 上一页1 2下一页 以往有几种β-地中海贫血的基因诊断方法，如PCR/ASO探针点杂交以及反向点杂交方法(PCR-RDB)，但由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及使用放射性核素而不易在临床进行推广,9,。与这些方法相比较，MASPCR则结合了等位基因特异性PCR技术及多重PCR技术两者的优点，在一个PCR反应体系中包括5对等位基因特异引物，在单一试管中几小时内即可检出几种常见的突变类型。而且就所检测的突变类型而言，该方法还可直接确定发生的突变是杂合性还是纯合性。另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因间不同的碱基被有意设计在每更多精品文档,欢迎来我主页查询 一引物的3′端，因而大大提高了扩增的特异性,另外由C1/C2引物对扩增得到的长1 434 bp的产物可作为整个反应体系的内对照，从而避免出现假阴性结果的出现，并显著提高了检测结果的稳定性,10,。尽管在每次反应中使用了多对引物，但通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，完全可以确保结果的特异性和稳定性。在本研究中，所有结果均在分娩或流产后进行了确认，结果与产前基因诊断完全一致。 在本实验中，来自家庭8的胎儿诊断为双重杂合子，因此建议孕妇流产，以避免重症β-地中海贫血病儿的出生。对于其他5例仅含一种突变类型的杂合子胎儿，在胎儿出生后成长过程中应注意的问题，对其父母提出了有益的建议。总之，MASPCR为β-地中海贫血的产前诊断提供了一种简便、经济、准确的方法，在优生科学领域具有广阔的应用前景。 【参考文献】 ,1, 曾溢滔. 人类血红蛋白,M,. 北京:科学出版社, 2002:162-173. ,2, 张宏秀,单可人,惠春林,等. 应用PCR-RDB技术对β-地中海贫血进行快速产前基因诊断,J,. 中华围产医学杂志, 2005,5(4):248-250. 更多精品文档,欢迎来我主页查询 ,3, HUANG S Z, ZHOU X D, ZHU H, et al. 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