栀子对闹羊花肝毒性的解毒效应的动物实验研究

栀子对闹羊花肝毒性的解毒效应的动物实验研究 栀子对闹羊花肝毒性的解毒效应的动物实 验研究 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.9时珍国医国药2011年第22卷第9期 栀子对闹羊花肝毒性的解毒效应的动物实验研究 姚敏,金柳燕,代文月,何丽关,高维琴,包怡敏 (上海中医药大学基础医学院,上海201203) 摘要:目的研究闹羊花的肝脏毒性以及栀子对闹羊花的肝毒性的解毒效应.方法?闹羊花的肝脏毒性试验,小鼠分别 灌胃生理盐水和不同浓度的闹羊花水煎剂2周后检测其血清中ALT的含量,并做肝脏病理切片;?栀子对闹羊花肝脏的 解毒效应实验,小鼠分别灌胃闹羊花,栀子,闹羊花与不同浓度栀子的水煎剂3周,检测肝脏匀浆中的GSH—Px与SOD 活性,MDA含量与血清中ALT与TG含量.结果闹羊花的肝毒性试验中,中浓度闹羊花组血清ALT明显高于空白组;各 浓度闹羊花组肝脏病理切片均有损伤,低浓度与中浓度闹羊花组损伤明显(P<0.05,P<0.01).栀子对闹羊花的肝毒性 的解毒效应实验中,闹羊花+中浓度栀子,闹羊花+高浓度栀子组肝脏GSH—Px,SOD活性均显着高于闹羊花组,闹羊花 +高浓度栀子组肝脏MDA,血清TG含量均显着低于闹羊花组(P<0.05,P<0.叭),并且两者配伍小鼠情况更稳定,各组 血清AI无统计学意义.结论闹羊花对小鼠具有肝毒性,栀子对闹羊花具有解毒效应,作用与减轻肝脏的氧化损伤有 关. 关键词:闹羊花;栀子;肝毒性;解毒;氧化损伤 DOI标识:doi:10.3969/i.issn.1008.0805.2011.09.060 中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编号:1008-0805(2Ol1)09-2183-02 近年来中草药的临床应用在治疗中日益增多,随之所引起的 不良反应也渐有增多,中药中毒致死的病例时有报道.积极研究 中药的致毒机理与预防,提高安全用药水平具有十分重要的 临床意义. 闹羊花为杜鹃花科羊踯躅的干燥花,又称羊踯躅,药性辛温, 有大毒,具有祛风除湿,散瘀定痛的作用.临床闹羊花中毒的 事件也不在少数,急性中毒严重者可以导致呼吸衰竭而死亡,使 用较长时间会出现肝脏功能损害的慢性中毒症状.栀子,为 茜草科栀子的干燥成熟果实,具有泻火除烦,清热利湿,凉血解 毒,保肝利胆的作用.据古代文献记载,栀子可解闹羊花毒, 如晋?葛洪《肘后备急方》载:"中踯躅毒者,以栀子汁解之",《本 草纲目》载:"羊踯躅,畏栀子",但是,现代药理尚未做详细研究. 因此,本课题通过小鼠灌胃实验,观察闹羊花的毒性以及栀子对 闹羊花是否有解毒效应,并初步探讨其机制. 1材料与仪器 1.1动物健康昆明种小鼠124只,雌雄各半,体质量(19?2)g, 上海中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK(沪) 2007—0005]. 1.2药品与试剂谷丙转氨酶(SGPT)测试盒,批号2010316;甘 油三酯(TG)酶法测试盒,批号2010010007;谷胱甘肽一过氧化物 酶(GSH—Px)测试盒,批号20100316;丙二醛(MDA)试剂盒,批 号20100316;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,批号20100316;考 马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,批号20100316,均购自南京建成生物 工程研究.A(R1),批号H929;A(R2),批号H915,购自世 诺有限公司.闹羊花购自安徽亳州源和堂,加适量蒸馏水煎煮成 生药含量0.3g/ml的水煎剂,再用蒸馏水稀释至生药含量 0.15g/ml与0.075g/ml的水煎剂;生栀子,批号100225,购自浙 江养和堂饮片厂,加适量蒸馏水煎煮成生药含量0.3ml的水 煎剂,再用蒸馏水稀释至生药含量0.15g/ml与0.075g/ml的水 收稿日期:2010-09-25;修订日期:2011-01.17 基金项目:上海市大学生创新项目(No.SHUTCMCXHD~); 上海中医药大学探索性综合实验项目 作者简介:姚敏(1987-),女(汉族),浙江杭州人,现在上海中医药大学 基础医学院2006级本硕连读,学士学位,主要从事基础研究工作. 通讯作者简介:包怡敏(1973一),女(汉族),上海人,现任上海中医药大 学副教授,硕士研究生导师,博士学位,主要从事基础研究工作. 煎剂. 1.3仪器uV一2100型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器 有限公司);JP200涡流匀浆机(53CHURCHHILLRD.NEWT— WON,CTU.S.A);80—2台式低速离心机(上海医疗器械有限公 司手术器械厂);VORTEX一6混匀器(海门市其林贝尔仪器制造 有限公司);日立7080型全自动生化分析仪(日本日立贸易有限 公司). 2方法 2.1闹羊花肝毒性实验 2.1.1动物分组与给药把24只小鼠分成空白组,低浓度闹羊 花组,中浓度闹羊花组和高浓度闹羊花组,每组6只,雌雄各半分 开,每天按10ml/kg分别灌胃生理盐水,0.75g/kg,1.5g/kg,3 kg闹羊花水煎剂,持续灌胃两周. 2.1.2指标检测与病理切片观察小鼠处死,取血清,通过日立 全自动生化分析仪进行ALT检测;取肝脏组织固定于10%的甲 醛中,石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜下进行病理观察.对 肝组织形态进行病理分级,积分:肝组织结构正常,无明显变 性,坏死及炎症细胞浸润,0分(一);肝小叶结构尚正常,可见明 显的混浊肿胀,气球样变或脂肪变性,散在点状坏死,1分(+); 肝小叶结构不清,可见明显的灶状坏死,伴有炎症细胞浸润,2分 (++);肝小叶结构不清,可见明显的片状坏死,伴有炎症细胞 浸润,3分(+++);坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央,层次较 多,伴有炎症细胞浸润,4分(++++). 2.2栀子对闹羊花肝毒性的解毒效应实验 2.2.1动物分组与给药确定适宜闹羊花毒性剂量为1.5g/kg, 把100只小鼠分成闹羊花组,栀子组,闹羊花+低浓度栀子组,闹 羊花+中浓度栀子组和闹羊花+高浓度栀子组.闹羊花组灌胃 0.15g/kg闹羊花水煎剂,5h后灌胃生理盐水;栀子组灌胃1.5 g/栀子水煎剂,5h后灌胃生理盐水;闹羊花+低浓度栀子组 灌胃1.5g/kg闹羊花水煎剂,5h后灌胃0.75g/kg栀子水煎剂; 闹羊花+中浓度栀子组灌胃1.5闹羊花水煎剂,5h后灌胃 1.5g/kg栀子水煎剂;闹羊花+高浓度栀子组灌胃1.5闹羊 花水煎剂,5h后灌胃3g/kg栀子水煎剂,每次灌胃剂量为10 ml/kg,持续灌胃3周. 2.2.2指标检测小鼠处死,取血清,采用比色法检测其血清 AIJT和TG含量;取肝脏组织,制备10%的组织匀浆,采用比色法 检测GSH—Px,SOD活性和MDA含量,组织蛋白采用考马斯亮 ? 2183? 时珍国医国药2011年第22卷第9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.9 蓝G一250法定量.操作步骤均按试剂盒说明进行. 2.3数据分析采用SPSS15.0统计软件进行数据分析.计量资 料以均数4-s差示,多组问比较用单因素方差分析(one — wayANOVA),两组问比较用LSD法,P<0.05为显着性差异 界值.计数资料采用Ridit分析统计处理,P<0.05为显着性差 异界值. 3结果 闹羊花毒性实验中1例小鼠灌胃后死亡,共取得23例样本. 栀子对闹羊花解毒效应实验中,8例小鼠死亡,共取得92例样 本. 3.1不同剂量闹羊花对小鼠血清ALT含量的影响中浓度闹羊 花组血清ALT水平明显高于空白组,P<0.05.结果见表1. 表1各组血清ALT含量(4-) 与空白组对照,P<0.05 3.2各组肝脏组织的形态学观察空白组肝脏病理切片基本表 现正常(见图1);各浓度闹羊花组均有不同程度的肝脏损伤,其 中低浓度闹羊花组肝脏病理切片显示肝细胞胞质疏松,严重水样 变性(见图2),中浓度闹羊花组肝脏病理切片显示肝组织坏死, 炎细胞浸润,轻度胞质疏松(见图3),高浓度闹羊花组肝脏病理 切片显示肝细胞胞质疏松,中度水样变性,中度淤血,见图4. 一?圈1空白组肝脏切片图2低浓度闹羊花组肝脏切片 ?? 于栀子组,P<0.01.结果见表3. 3.4各组血清中ALT与TG含量闹羊花+高浓度栀子组的 TG含量与闹羊花组和栀子组比较,明显降低,P<0.05.结果 见表4. 4讨论 现代药理研究表明,闹羊花含有八厘麻毒素和石楠素等多种 毒素,具有镇痛,降低血压,减缓心率和呼吸作用,使用过长时 间会引起肝脏毒性.在中药肝毒性中,氧化损伤中是一个重要的 病理过程,会造成体内自由基堆积.自由基一部分可被机体自由 基清除剂所清除,一部分则对肝细胞的质膜系统造成攻击,使不 饱和脂肪酸发生过氧化反应,产生过氧化脂质,影响肝细胞的正 常代谢,引起肝细胞衰老与凋亡这种"氧化损伤"已成为目前 公认且重要的肝毒性损伤机制,主要变化为脂质过氧化产物丙二 醛(MDA)含量升高,自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD),过氧 Px),谷胱甘肽 化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH— (GSH)活性下降. 表3各组肝脏组织中GSH—Px,SOD活性 与MDA含量的比较(i?s) 与闹羊花组比较,P<0.05,一P<0.01;与栀子组比较,P<0.05,P<0O1 表4各组血清中ALT,TG含量的比较(i?S) 与闹羊花组比较,P<0.05,一P<0.O1;与栀子组比较,P<005 图3中浓度闹羊花组肝脏切片图4高浓度闹羊花组肝脏切片 与空白组对照,各浓度闹羊花组的肝脏损伤严重,P<0.01. 结果见表2. 组别 表2各组肝组织形态学病理分级 墅堡坌塑P 一 ++++4-4--4-4-4-4- 与空白组对照,一P<0.Ol 3.3各组肝脏组织中GSH—Px与SOD活性及MDA含量与闹 羊花组相比,闹羊花+中浓度栀子组,闹羊花+高浓度栀子组 GSH—Px活性显着升高,MDA含量明显降低(P<0.05,P< 0.o1);闹羊花+高浓度栀子组的SOD活性明显高于闹羊花组, 陋子组(P<0.05);闹羊花+中浓度栀子组的MDA含量明显低 ? 2】84? 我们对闹羊花肝脏毒性的研究显示,给药两周后小鼠即出现 肝细胞浊肿,脂肪变性,甚至腔内细胞坏死,肉芽组织填充,个别 出现气球样变,中浓度闹羊花组血清ALT明显升高,由此证明闹 羊花水煎剂对小鼠具有肝脏毒性,灌胃剂量为生药含量1.5g生 药/kg时肝毒性最明显.由此通过实验确定1.5g生药/kg作为 小鼠适宜闹羊花毒性剂量. 解毒实验结果显示,闹羊花+高浓度栀子组的血清TG含量 明显低于闹羊花组和栀子组,说明高剂量栀子对具有保护肝细 胞,改善肝功能的作用.而栀子组,闹羊花+低与高浓度栀子 组血清ALT含量皆低于闹羊花组,虽然尚无统计学意义,但也体 现了栀子能解闹羊花毒的趋势.有研究表明,急性肝中毒实验 中,ALT由于解毒途径的激活,其值在短时间内即能恢复到比 正常值稍高范围,这可能是导致闹羊花+中浓度栀子组血清 ALT升高的原因.由于过氧化性物质和ALT的共同测定对慢性 肝过氧化损伤的诊断价值优于ALTj,因此ALT比较适合作为 急性肝损伤实验的指标. 为了探讨栀子解闹羊花毒的机制,我们观察了肝脏匀浆中 GSH—Px,SOD活性和MDA含量,其中GSH—Px活性与肝毒性 氧化损伤机制相关性较大,灵敏性很强".结果表明,栀子解毒 组肝脏匀浆中MDA明显降低,GSH—Px,SOD活性显着升高,说 明由闹羊花引起的氧自由基所致的脂质过氧化反应加速,大量消 耗还原性物质导致脂质代谢物在组织内大量堆积的损伤后果得 到明显的改善,可见氧自由基导致脂质过氧化是闹羊花慢性肝损 伤机制中很重要的因素.综合3个浓度栀子的解毒效果来看,高 剂量栀子(3g/kg)对于闹羊花引起的肝损伤的保护作用最为有 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.9时 珍国医国药2011年第22卷第9期 效,低剂量(0.75g/kg)保护作用不明显. 同时应当指出的是,有研究表明一定剂量栀子水提物,醇提l3J 物对于肝脏也具有毒性.而从我们的实验中综合来看,闹羊 花+高浓度栀子组肝脏SOD活性比栀子组明显升高,闹羊花+_斗 中浓度栀子组的肝脏MDA比栀子组较明显降低,闹羊花+高浓… 度栀子的血清TG含量相对于栀子组明显降低,可见灌胃闹羊花 +栀子组的各项指标比单喂栀子更稳定.在蒙药中有一味六味r1 木香散,同时采用了闹羊花和栀子,我们认为除了与两者的药效 有关之外,可能也和闹羊花与栀子配伍比单用栀子或者是闹羊花『7] 都更安全有关系. 目前对于中药中毒,除了催吐,洗胃及导泻等排除毒物的方[8] 法,在临床上没有更深入的解毒研究.通过对于中药配伍的不断[9] 探索,不仅可规避中药毒性的临床风险,提高安全,增效的中药应 用水平,而且可发现防治药物性肝损害的有效中药,拓宽用药思l?J 路,为药物性或毒物性肝损害治疗做出贡献.… 参考文献: [1]赵国平,戴慎,陈仁寿.中药大辞典,第2版[M].上海:上海科学l12J 技术出版社,2006:2040. [2]张智,闪增郁,向丽华,等.15味有毒中药小鼠半数致死量的实 验研究[J].中国中医基础医学杂志,2005,11(6):435. 刘晓堂,赵伯涛,张玖,等.栀子的综合开发与利用[J].中国野生 动物资源,2008,27(1):19. 何桂霞,李玲,肖锦正,等.藤茶总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤 小鼠的保护作用[J].湖南中医学院,2004,24(4):7. 杜贵友,方文贤.有毒中药一现代研究与合理应用[M].北京:人民 卫生出版社,2003. 刘平,袁继丽,倪力强,等.重视中药肝损伤的问题[J].中国新药 与临床杂志,2007,26:388. 戴万亨,蒋梅先,成战鹰,等.诊断学基础[M].北京:中国中医药出 版社,2007:267. 施安国.药物的肝脏损害[J].药学服务与研究,2005,5(2):186. 齐双岩,熊彦红,金若敏,等.川楝子致小鼠肝毒性时效,量效关系 研究[J].时珍国医国药,2008,19(11):2694. 罗运好,黄汉辉,王燕莉,等.丙戊酸钠对幼鼠代谢的影响及肝毒性 的试验探讨[J].生物医药,2009,16(9):59. 孙蓉,李素君,黄伟,等.氧化损伤相关指标在中药肝毒性损伤 机制中作用与研究进展[J].中药药理与临床,2009,25(1):80. 王波,杨洪军,高双伦,等.栀子对大鼠肝.肾毒性的病理学观察 [J].中国实验方剂学杂志,2007,13(5):45. 压力溶剂萃取法提取山茱萸环烯醚萜苷工艺的研究 朱君燕,黄瑜秋,范晓良,白岩,潘兰英 (1.浙江农林大学,浙江临安311300;2.浙江工业大学,浙江杭州310014) 摘要:目的优化压力溶剂萃取法提取山茱萸环烯醚萜苷的工艺条件.方法采用正交实验法,考察乙醇浓度,压力,温度 及时间对环烯醚萜苷得率的影响.结果最佳工艺条件为:90%乙醇,压力90bar,温度60?,时间20min.结论与传统 提取方法相比,压力溶剂萃取法节约了时间和溶剂消耗量,具有一定优势. 关键词:压力溶剂萃取;环烯醚萜苷;莫诺苷;马钱苷 D0I标识:doi:10.3969/i.issn.1008-0805.2011.09.061 中图分类号:R284.2文献标识码:B文章编号:1008-0805(2011)09?2185-03 山茱萸为一味常用的名贵中药材,是山茱萸科植物山茱萸 ComusofficinalisSieb.etZucc.的干燥成熟果肉,以其补力平和, 壮阳而不助火,滋阴而不腻膈,收敛而不留邪之功效,被医药学家 所喜用.山茱萸含有环烯醚萜苷,有机酸,多糖,皂苷,鞣质和氨 基酸等多种物质,其中环烯醚萜苷成分又以莫诺苷与马钱苷为 主.药理研究表明,环烯醚萜类化合物是一类具有抗肿瘤,保肝 利胆,解痉镇痛,增强免疫,抗氧化,降糖降脂等生理作用的天然 活性分子. 压力溶剂萃取(PressurizedSolventExtraction,PSE)是美国应 用分离公司(AppliedSeparations)近年推出的一种分析样品前处 理技术,由早期美国戴安公司的加速溶剂萃取(Accelerated SolventExtraction,ASE)发展而来.该技术通过升高压力来提高 溶剂的沸点,使正常萃取程序能够在高于溶剂沸点的温度,而溶 剂保持液体状态下进行,进而大大缩短萃取时间,提高萃取效率 并显着降低溶剂消耗.ASE法被美国国家环保局批准为 EPA3545号标准方法J,在农药残留检测,食品药品成分分 收稿日期:2010-08.23;修订日期:2010.12—15 基金项目:浙江农林大学科研发展基金项目(No.2006FK26) 作者简介:朱君燕(1989一),女(汉族),浙江温岭人,现为浙江农林大学林 业与生物技术学院2007级中药学专业学生. 通讯作者简介:黄瑜秋(1980一),女(汉族),浙江临安人,现任浙江农林 大学林业与生物技术学院实验师,硕士学位,主要从事天然产物的提取分 离研究工作. 析等领域都得到了广泛应用.本研究选择山茱萸中莫诺苷, 马钱苷及两者之总苷为考察指标,采用单因素考察及正交实验优 选PSE法的提取工艺条件,并与传统的回流提取,超声提取技术 进行了比较. 1仪器与试药 1.1仪器压力溶剂萃取仪(OnePSE),AppliedSeparations;Met— tlerToledoAB256一s型电子天平;Waters515型高效液相色谱 仪,Waters2487型紫外检测器等. 1.2试剂,药品蒸制山茱萸购自杭州华东中药饮片有限公司; 马钱苷标准品购自中国药品生物制品检定所,纯度?98%;莫诺 苷标准品购自上海鼎瑞化工有限公司,纯度?98%;乙醇(AR), 甲醇(HPLC),纯净水等,均为国产试剂. 2方法 2.1莫诺苷,马钱苷的测定方法 2.1.1样品溶液的制备山茱萸饮片烘干,打成约60目粗粉,按 各法进行提取实验.提取液蒸去溶剂后,用30%甲醇稀释,定 容. 2.1.2色谱条件色谱柱:XBridge一Cl8柱(4.6mm×250mm, 5m);流动相:甲醇一水(27:73);检测波长:240nm;柱温:室 温;流速0.9ml?min,;进样量20l. 2.1.3标准曲线的绘制精密称取莫诺苷与马钱苷标准品适量, 加入流动相超声溶解,定容,配制成不同浓度的标准品溶液各5 份进行检测.得到莫诺苷在0.023,0.459mg?ml间的线性回 ? 2185?