【doc】低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响

【doc】低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响 低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能 的影响 中国现代神经疾病杂志2006年2月第6卷第1期ChinJCon— tempNeurolNeurosurg,F — ebruary2006,Vo1.6,No.1?47? 低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接 通讯功能的影响 闫华只达石黄慧玲张文治苏心刘锐 【摘要】目的探讨低温治疗对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响.方法常规体外培养 大鼠神经干细胞,传代2次后加入10%胎牛血清诱导其向神经胶质细胞分化,25个培养皿中胶质细胞培 养至致密单层细胞,平均分为5组:常温组,培养皿置入37?,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h; 低温组,置入30?,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h;常温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿, 置入37?,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h;低温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿,置于30 ?,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h;佛波酯阳性对照组,于37?,5%CO饱和湿度培养箱内继 ,利用划续培养22h,加入佛波酯继续培养2h,工作液浓度5ng/ml.各组培养至24h后痕标记染料示踪 技术在激光扫描共聚焦显微镜下,通过荧光黄扩散距离测定胶质细胞间缝隙连接通讯水平.结果常温 组染料5min扩散距离为(160.5~8.6)Ixm;低温组缝隙连接通讯明显受到抑制,扩散距离为(126.2~10.4) Ixm,与常温组相比差异具有显着性意义(尸<0.05);常温轻度缺氧组扩散距离为 (154.1~'-6.9)Ixm;低温轻 度缺氧组扩散距离为(122.8~6.0)Ixm,与常温轻度缺氧组相比差异亦有显着性意义 (P<0.05);但常温组 与常温轻度缺氧组相比,低温组与低温轻度缺氧组相比,差异均无显着性意义 (P>0.05).结论低温能 够降低神经胶质细胞间缝隙连接通讯功能. 【关键词】低温神经胶质细胞交流细胞外隙 EffectsofhypothermiaongapjunctionalintercellularcommunicationofgIialcellsYANHua',ZHI Da-shi,HUANGHui-ling,ZHANGWen-zhi~SUXin,LlURuL'TianjinMedicalUniversityandHuanhu Hospital,Tianjin3O0070.China 【Abstract】 ObjecdveTostudytheeffectsofhypothermiaongapjunctionalintercellularcommunica- tion(GJIC)ofglialcellsinrats.MethodsNeuralstemcellswere:cultivatedbyroutinemethodinvitro.and inducedtodifferentiateintoialcellswith10%fetalbovineserumafter2passages.Whenalcellsin25 disheswerecultivatedintoconfluentmonlayercells.anddividedinto5groupscontineouslycultivatedinin. cubatorundersaturatedhumidity:1)Normothermiagroup— cellsincubatedat37oCand5%CO2for24h.21 Hypothermiagroup-cellsincubatedat30oCand5%C02f0r24h.3)Normothermiawithmildanoxiagroup— cellsincubatedinsealeddishesat37?and5%CO2for24h.4】 Hypothermiawithmildanoxiagroup-cells incubatedinsealeddishesat30oCand5%CO2for24h.5)TheA(tetradecanoylphorbolacetate)positive controlgroup— cellsincubatedat37oC,5%CO2for22handanother2hinthepresenceof5ng/mlIPA.The effectsofhypothermiaonGJICofialceHsweredeterminedbymeasuringfluoresceindiffusionlengthusing scrape-loadinganddyetransfer(SLDT)techniquewithlaserscanningconfocalmicroscope(LSCM).Results Innormothermiagroup,thediffusionlengthin5minuteswas(160.5~8.6)Ixm.-I1leGJICofglialcellsinhy. pothermiagroupwasobviouslysuppressed,inwhichthediffusionlengthwas(126.2~10.4)Ixmwithsignificant differencecomparedtotheinnormothermiagroup(P<0.05).Thedisionlengthsnormothermiawithmild hypoxiagroupandhypothermiawithmildanoxiagroupwere(154.1t:6.9)Ixmand(122.8-*6.0)Ixmrespectively, therewassignificantdifferencebetweenthetwogroups<0.05),buttherewasnosignificantdifferencebe. tweennormothermiagroupandnormothemiawithmildanoxiagroup,hypothermiagroupandhypothermiawith mildanoxiagroup>0.05).ConclusionHypothermiacoulddecreasegapjunctionalintercellularcommuni. catingfunctioninialcells. 【Keywords】HypothermiaNeurogliaCellcommunicationExtracellularspace 作者单位:300070天津医科大学(闷华,刘锐);天津医科大学总医 院(只达石);天津市环湖医院神经细胞研究室(黄慧玲,张文治,苏 心) ? 论着? 低温具有广泛的生物学效应,作为一种新兴的 物理治疗手段可广泛应用于神经系统疾病,由于治 疗温度,治疗时间,病例选择的不同,不同治疗中心 中国现代神经疾病杂志2006年2月第6卷第1期 ChinJContempNeurolNeurosurg,February2006,Vo1.6,No.1 得出的治疗结果存在差异,其中多数动物实验和小 样本临床试验性治疗效果都是肯定的.然而,低温 脑保护的作用机制尚不十分明确,有必要对其做进 一 步的深入研究.胶质细胞间具有广泛的细胞间缝 隙连接通讯(gapjunctionalintercellularcommunica— tion,GJIC),这种连接通讯参与了胶质细胞的生长, 发育,增殖,分化和死亡等许多重要细胞生物学过 程的调控,是促进细胞增殖的重要机制之一,参与 细胞间多种信号的转导和物质运输.从细胞之间相 互作用形成"细胞社会"的观点出发,为了解低温是 否通过影响细胞间缝隙连接通讯功能而影响胶质 细胞间信息和物质交流,我们选择了常温,低温,常 温轻度缺氧,低温轻度缺氧等4种细胞培养条件, 利用激光扫描共聚焦显微镜,观察温度对致密胶质 细胞间缝隙连接通讯功能的影响,旨在探索低温的 生物学效应及其作用机制. 材料与方法 一 ,材料 1.试剂荧光黄(LY,美国Sigma公司).阳性 对照物佛波酯(12.O—tetradecanoylphorbo1.13一ac— etate,TPA,美国Sigma公司).DMEM培养液(美国 Gibco公司). 2.仪器TE一2000激光扫描共聚焦显微镜(日 本Nikon公司).TG150型CO细胞培养箱(法国 Jouan公司). 3.细胞由Wister胎鼠神经干细胞扩增,分化 形成. 二,实验方法 1.胎鼠神经胶质细胞的诱导培养选用清洁级 Wistar孕15-18d鼠(中国人民解放军军事科学院 第四研究所实验动物中心提供)引颈处死,安尔碘 消毒腹部,于无菌条件下取胎鼠两侧大脑半球,剥 除脑膜,机械分散细胞,经100目不锈钢滤网过滤, 接种于25ml培养瓶中,于37?,5%CO饱和湿度 培养箱内培养.培养液为DMEM/F12无血清培养 基,并加入胰岛素5mg/L,铁蛋白100mg/L,腐胺 100Ixmol/L,亚硒酸钠3Onmol/L,青霉素100U/ml, 链霉素100U/ml和谷氨酰胺2mmol/L.于接种之日 添加促有丝分裂因子上皮细胞生长因子(EGF)20 g/L和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20tLg/L. 2-3d半量换液,7d左右传代1次.待神经干细胞大 量扩增后加入10%胎牛血清促进细胞分化,待长满 瓶底后,接种于直径为3.5cm塑料培养皿中,培养 至致密单层细胞后继续培养2d待用. 2.细胞间缝隙连接通讯功能测定采用EL- Fouly等?划痕标记染料示踪技术(scrape?loading anddyetransfer,SLDT)并略加改进.将上述培养皿 ,每组5个.(1)常温组:置入37.I=,5%COz 分为5组 饱和湿度培养箱内继续培养24h.(2)低温组:置入 30.I=,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h.(3) 常温轻度缺氧组:使用封口膜封闭培养皿,置入37 .I=,5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h.(4)低 温轻度缺氧组:使用封口膜封闭培养皿,置于3O.I=, 5%CO饱和湿度培养箱内继续培养24h.(5)TPA 阳性对照组:于37?,5%CO饱和湿度培养箱内继 续培养22h,加入TPA继续培养2h,工作液浓度5 ng/n~.各组培养至预定时间后,以预温至37.I=的 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.4)轻轻冲洗细胞3 次,加入预温的质量浓度为0.05%的荧光黄2Hll,用 锐利手术刀片切刻塑料培养皿细胞面,标记5min, 吸出荧光黄,再以磷酸盐缓冲液冲洗3次,去除游 离的荧光染料及脱落细胞,加入4%多聚甲醛液固 定细胞.然后,于激光扫描共聚焦显微镜下经488 nm激光激发观察绿色荧光扩散情况.每组5个平行 皿,每皿平行刻痕4条,测量刻痕两侧荧光扩散的 距离. 三,统计分析方法 实验数据以均数?差()表示,多组均数 的比较采用方差分析,组间均数的两两比较行 Newman?Keuls法检验,通过SPSS11.5软件计算. 结果 低温组细胞刻痕标记后,荧光扩散距离明显短 于常温组(图1,2);低温轻度缺氧组胶质细胞荧光 扩散距离明显短于常温轻度缺氧组(图3,4);波佛 酯(5ng/na)阳性对照组作用2h后,细胞问缝隙连 接通讯几乎完全阻断,荧光仅限于沿刻痕单层细胞 内(图5). 细胞间缝隙连接通讯功能测定显示,细胞刻痕 标记后荧光扩散距离下列各组问差异具有显着性 意义:低温组与常温组(q=13.295,P<0.05);低温轻 度缺氧组与常温轻度缺氧组(q=12.132,P<0.05); 低温轻度缺氧组与常温组(q=14.612,P<0.05),但 无实验意义;低温组与常温轻度缺氧组(g=10.814, P<0.05),但无实验意义.其余各组间差异均无显着 一一,一,一一,,一一,一一,一一一 中国现代神经疾病杂志2006年2月第6卷第1期 ChinJContempNeurolNeurosurg,February2!o1.:!: 讯的分布和耦联是动态变化的,大量证据表明,神 经递/调质可以影响神经元的电耦联或染料耦联, 这种调节作用一般是连接蛋白亚单位被不同的蛋 白激酶磷酸化导致的【4l. 测定缝隙连接通讯功能采用划痕染料示踪技 术,是利用划痕造成细胞损伤将染料荧光黄(一种 黄色带电荷的小分子强荧光物质,相对分子质量为 457.2,不能通过细胞膜,但很容易通过缝隙连接)导 人细胞内,荧光黄从标记的细胞向邻近细胞扩散, 以扩散的距离作为评价缝隙连接通讯功能的指标. 佛波酯在体外研究中可以抑制许多细胞的缝 隙连接通讯功能[51,选用其作为阳性对照组的另一 原因是神经细胞和神经胶质细胞往往具有较长的 突起,通过佛波酯抑制缝隙连接通讯实验证实,远 离刻痕两层以上的细胞荧光着色是由缝隙连接通 讯将染料在细胞间扩散形成,排除远处细胞长突起 直接由刻痕处吸收染料而产生荧光的现象. 随着研究的进一步深人,神经胶质细胞的功能 越来越受到重视,现已公认胶质细胞具有营养,支 持,隔离与绝缘,引导发育神经元迁移,屏障,修复 与再生,免疫应答以及调节神经元的功能等作用, 且数量约为神经细胞的1O倍或更多.研究观察到 神经元之间,神经元与胶质细胞之间,胶质细胞之 间均存在细胞间缝隙连接通讯,其中星形胶质细胞 之间具有最广泛的缝隙连接联接[61.细胞间的缝隙 连接使得众多细胞间形成代谢耦联,当一个细胞受 损时,除引起自身的死亡或凋亡以外,还会将其产 生的有害代谢产物和伤害信息通过缝隙连接通讯 传递给与其耦联的正常细胞,造成该细胞的损伤甚 至死亡,使更多的功能受损.同理,也可能推测出当 细胞受损后,由于其自身修复能力的局限,往往需 要健康细胞与其建立耦联,通过此种形式协助其代 谢有害废物,并且运输有益物质进人细胞,并可能 将修复的外来信息通过缝隙连接通讯传人受损细 胞,启动修复的机制.鉴于细胞间存在此种重要的 相互影响结构,可能存在上述的物质和信息影响机 制,如何利用此种机制进一步减少损伤的扩大和促 进受损细胞修复具有重要的实用价值. 在各种原因所致的脑损伤后脑组织往往存在 缺氧现象.Cotrina等【刀将脑片置于无糖,无氧气输入 培养条件下孵育15min,证实缺血缺氧状态下缝隙 连接仍处于开放状态,缝隙连接通讯功能仍然存 在.Martinez等[81将星形胶质细胞在体外无氧气输人 条件下培养12h,证实细胞间仍存在染料耦联,提示 缝隙连接通讯功能仍然存在.因此,星形胶质细胞 在缺血和缺氧情况下仍可能保持缝隙连接通讯功 能.考虑在神经系统发生损伤时,可能并非完全处 于缺氧状态,亦会存在部分缺氧情况.故在本实验 中,笔者除了采用正常氧浓度模型测定低温对缝隙 连接通讯功能的影响外,还采用密闭培养皿模型, 造成皿内氧气逐步消耗,氧浓度逐步降低和二氧化 碳浓度逐步升高的过程,尽量模拟脑组织部分缺氧 状况.结果证实胶质细胞在轻度缺氧状态下,短期 内缝隙连接通讯无明显改变,损伤早期的有害性电 信号和有害物质仍可在细胞间进行传递;有益的电 信号和营养物质同样也可以在细胞间通过缝隙连 接通讯进行传递.分析缝隙连接通讯未发生明显改 变的原因,可能是培养皿内氧气浓度虽有所降低, 但尚能够维持胶质细胞的基本功能,包括缝隙连接 通讯的功能;或者是细胞功能可能已经下降和轻度 损害,但细胞间通道尚未见明显受损,因为胶质细 胞的"合胞体"形式的功能和代谢方式需要细胞间 维持沟通. 以往众多研究证实,脑损伤急性期后,在损伤 灶四周,尤其是半暗带区会出现继发性损伤,有大 量细胞会出现凋亡.考虑可能是由于直接受损或损 伤严重的细胞将有害物质或有害信息通过缝隙连 接通讯传递给周围正常或受损较轻的细胞,引起其 受损或使损伤加重,当细胞无法修复时,将引起该 细胞凋亡[9l.此机制亦正是目前肿瘤基因治疗的重 要机制之一,即通过缝隙连接通讯实现旁观者效应 (bystandereffect).研究发现,脑缺血时梗死灶中心 区自动发放扩散性抑制波(spreadingdepression, SD),并向外周的半暗带区及正常组织区扩散,其数 量及频率与最终的梗死体积之间存在明显的相关 性I1o}.缝隙连接阻断剂辛醇能够减少正常脑片在高 钾离子诱发的扩散性抑制波的数量.给大鼠脑缺血 模型应用缝隙连接阻断剂,如辛醇,氟烷,观察到梗 死体积的缩小和扩散性抑制波减少.还有缺血中心 区三磷酸腺苷迅速耗竭,仍保持开放的缝隙连接通 讯将附近存活的星形胶质细胞的三磷酸腺苷顺着 浓度差运送到垂死的细胞内,导致更多的细胞因能 量短缺而受损[111.由上述现象推论,神经系统损伤早 期损害信息传导所造成的影响可能大于修复信息 的影响,故降低缝隙连接通讯可能减少已经损伤细 胞的有害物质和信息在细胞间传递造成的"旁观者 中国现代神经疾病杂志2006年2月第6卷第1期 ChinJContempNeurolNeurosurg,February2006,VoJ..1?51? 损伤效应",随着严重损伤细胞的死亡崩解,其与周 边细胞的脱耦联,致使能够传递损伤信息的电信号 和化学信号消失,如钙波中断,使周围细胞得到保 护.由于神经元通过胶质细胞获取养分和运输代谢 产物,胶质细胞间通过缝隙连接通讯进行营养分配 和缓冲神经元活动时外部钾离子浓度,对维持神经 元的功能起重要作用,所以长期的抑制缝隙连接通 讯,特别是损伤修复期,将会损伤神经细胞.在损伤 修复期,由于白细胞,小胶质细胞,脑脊液循环的清 除作用,损伤区的有害物质减少,此时恢复缝隙连 接通讯有可能使得度过急性期的受损细胞与周围 正常细胞建立缝隙连接通讯,使修复信号和营养物 质进入待修复细胞,从而促使轻度损伤的细胞得以 快速恢复,进而改善神经元的生存微环境,提高神 经功能恢复的质量. 本实验从神经系统广泛存在的缝隙连接通讯 出发,观察到低温能够降低细胞问通讯功能,在损 伤早期,特别是超早期时,可能有害信息在细胞间 传递带来的负面影响会超过修复和营养物质在细 胞间传递产生的正面影响,此Il'f应用低温降低缝隙 连接通讯,减少了细胞问物质和信息传递造成的 "旁观者损伤效应",具有减少神经系统损伤的效 果,可能是早期应用低温治疗有效的作用机制之 一 .但随着损伤恢复的进行,在修复信号产生的正 面效果超过损伤信号产生的负面效果时,如果继续 应用低温,从缝隙连接通讯功能角度考虑将有碍恢 复.以后进一步量化不同程度损伤时,降低缝隙连 接通讯和加强缝隙连接通讯的时间点,就低温治疗 来说,确定降温和复温临界时间点,体现临床个性 化治疗,将对临床低温治疗具有现实的指导意义. 低温治疗过程中降低缝隙连接通讯功能,理论上具 有潜在的致瘤性.关于缝隙连接通讯的研究时间尚 短,加强和减低其功能,所引起的长远生物安全性 问题尚有待进一步研究. 参考文献 1EL-FoulyMH,TroskoJE,ChangCC.Scrape—loadingandayetrans— fer:arapidandsimpletechniquetostudygapjunctionalintercellular 2廖德祥.连接蛋白43的l临床研究进展.医学综述,2003,9:76—78. 3俞萍,唐玲芳,冯致英.镉对中国仓鼠成纤维细胞活力和缝隙连 接通讯功能的影响.中华劳动卫生职业病杂志,1999,17:342— 345. 4李文昌.神经组织缝隙连接.生理科学进展,1999,30:321—325. 5OhSY,MadhukarBV,TroskoJE.Inhibitionofgapjunctionblock— agebypalmitoylcarnitineandTMB一8inaratliverepithelialcell line.Carcinogenesis,1988,9:l35一l39. 6黄建敏.缝隙连接与癫痫的关系.国外医学神经病学神经外科学 分册,2004,3l:270—273. 7CotrinaML,KangJ,LinJrt,eta1.Astrocyticgapjunctionsremain openduringischemicconditions.JNeurosci1998l8:2520—2537. 8MartinezAD,SaezJC.Regulationofastroeytegapjunctionsbyby? 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