新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析

新疆酸奶子中乳酸菌多样性 第43卷第7期 Vo1.43No.7 山东大学学报(理学版) JournalofShandongUniversity(NaturalScience) 2008年7月 Ju1.20o8 文章编号:1671.9352(2008}07-0018.05 新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析 赵蕊,霍贵成 (东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030) 摘要:从15份采自新疆伊犁牧民家庭传统方法制作的酸奶子中分离出71株乳酸 茵,并进行了生理生化表型特征 鉴定.对其中的28株茵测定了16SrRNA基因全序列,构建系统发生树,结合生理 生化结果,鉴定结果为,该酸奶 子中乳酸茵涉及5个属,11个种及亚种,有些菌株对生长温度适应性较强.乳杆菌 为新疆酸奶子中的优势茵属, 以瑞士乳杆菌(13.helveticus)为最优势. 关键词:传统乳制品;乳酸茵;多样性 中图分类号:TS252.56:Q93—331文献标志码:A DiversityoflacticacidbacteriaisolatedinsourmilkfromXinjiang ZHAORui,HUOGui—cheng (KeylaboratoryofDairyScience,MinistryofEducation,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,Heilongjiang,China) Abstract:Seventyonelacticacidbacterialstrainswereisolatedfi-om15samplesofnaturallyfermentedsoUl”milkcollectedfrom thefarmyardsinXinjiang.Theywereidentifiedbyphysiologicalandbiochemicaltests,28ofthemwereful’theranaly~byse— quencingtheir16SrRNAgenes.Basedonconstructingphylogeneticneighbor-joiningtrees,theresultsincombinationwithtradi— tionaltaxonomicmethodsbasedonphenotypiccharacteristicsshowedthatthelacticacidbacteriaintraditionaldairyproductscoV— ered5generaand11speciesorsubspecies./zwtobac///usWasthepredominantgenus,ofwhich13.helvetieuswasthemostpre— dominantsll~in.Someshacouldadapttoawidetemperaturerange. Keywords:traditionalfermenteddairyproduct;lacticacidbacteria;biodiversity 0引言 在中国及东南亚地区的传统发酵食品中,蕴藏 着大量未知微生物,是探索有用微生物菌种的绝好 宝库.中国新疆地区哈萨克族和蒙古族等少数民族 自古以来就有制作和食用发酵乳制品的习惯.他们 以牛乳,水牛乳,羊乳,牦牛乳,马乳,骆驼乳等作为 原料,采用传统的制作工艺制成各种传统乳制品,如 奶皮子,稀奶油,酸奶子,奶豆腐,奶干,奶酒,奶疙 瘩,马奶酒和黄油等J.传统的乳制品制作方法有 着明显的地域性以及户籍性,从而做成的乳制品有 着浓厚的地区特色和风味.经过几千年的驯化,这 些传统乳制品中保留了许多赋予乳制品独特风味的 乳酸菌,为发酵乳制品菌种的分离筛选以及研究开 发提供了宝贵的资源J.我国学者曾研究了内蒙 古,新疆,云南,西藏,青海等地区的传统乳制品,产 品类型涉及到乳饼,乳扇,酸马奶,开菲尔粒,发酵山 羊乳,发酵骆驼乳等?3引,并从中分离得到许多有优 良特性的菌株.这些研究中针对内蒙古传统乳制品 居多. 酸奶子(酸奶)是蒙古族,达斡尔族等少数民族 最常用的一种乳制品,是鲜奶经自然发酵制成,乳 其中酪蛋白遇酸凝固,即成酸奶.口感 发酵变酸, 清酸爽口,开胃增食,是农牧民野外,农耕,放牧 的理想食品,并且是制作奶干,奶豆腐的原料J. -25 收稿日期:2008-04 基金项目:国家”863”资助项目(2006AA10Z344) 作者简介:赵蕊(1982.),女,博士研究生,从事乳品微生物的研究. *通讯作者:霍贵成0958一),男,教授,博士生导师,研究方向为乳品加工与食品微 生物.Emall:gchuo58@126.coin 第7期赵蕊,等:新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析19 新疆地区少数民族牧民制作的酸奶子历史悠久,经 验丰富,酸奶子自然发酵过程中形成的微生物类群 受多种因素影响,使用传统方法在长期自然选择保 留下来的发酵菌种,利于进行微生物多样性分 析.本试验在进行了大量生理生化试验的基础上, 选取代表菌株进行16SrRNA基因序列分析,并将两 种方法的结果结合,对菌株进行较为全面,准确的鉴 定. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1样品来源 15份酸奶子均采集自新疆维吾尔自治区伊犁 巩留地区用传统工艺制造酸奶子的牧民家庭.采集 酸奶子装于灭菌的离心管内,封严后放入冰盒.空 运至实验室,一20?保存至使用. 1.1.2株来源 嗜酸乳杆菌ATCC4356(Lactobacillusacidophi. ),乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC19435(Lactococcus lactissubsp.1actis),均购自中科院微生物研究所菌 种保藏中心. 1.2仪器设备 (bioer),凝胶成 光学显微镜(OLMPUS),PCR仪 像系统(uVP). 1.3各种培养基与试剂 乳酸菌富集用加富的脱脂乳培养基(10%脱脂 乳,0.5%蛋白胨,0.25%酵母粉,1%葡萄糖);分离 培养采用MRS培养基(分离乳酸菌)和M17培养基 (分离乳酸球菌)].做生理生化试验所用的培养基 均按照文献[10]的方法配制.H’s生成试验,各种 糖发酵试验的培养基均为浙江杭州天和微生物试剂 有限公司生产的细菌微量生化反应管. 1.4乳酸菌的分离与纯化 取一定量的样品,用加富的脱脂乳培养基活化 2代后,划平板,37?培养24,48h.分离明串珠球 培养24, 菌时用的是MRS培养基(pH6.2),在25? 48h.菌落形态,挑特征性的菌落,继续划平 板,至确定为纯菌.同时做革兰氏染色和过氧化氢 酶试验,将革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性的菌暂定为 乳酸菌.将纯化后的菌株进行斜面保存,甘油法低 温冻存和冻干保存. 1.5乳酸菌的生理生化鉴定 参照文献[4,5,10.12],将革兰氏阳性,过氧化 氢酶阴性的菌株暂定为乳酸菌.将硝酸盐还原试 验,H’S产生试验,明胶液化试验,吲哚试验结果均 为阴性的杆菌鉴定为乳杆菌属.鉴定乳酸乳球菌, 需要做硝酸盐还原试验,6.5%NaC1生长试验,4% NaC1生长试验,葡萄糖产气试验,10?和45?生长 试验,进而区分肠球菌属,链球菌属,乳球菌属和明 串珠球菌菌属,再分别进行糖发酵试验. 1.616SrRNA基因序列分析 1.6.1DNA的提取 用Wizard@GenomicDNAPurificationKit试剂盒 提取乳酸菌的染色体DNA,按说明书操作. 1.6.216SrlLNA基因序列的测定 参照文献[13],PCR扩增的引物为16SF(5. AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3)和16SR(5’-CTACG. GCTACCTIGTrACGA.3).PCR反应体系如下:dNTP 400tanol/L,10×PCRbuffer(含MS)5L,弓l物各 1/~mol/L,Taq酶(aRa)0.5U,模板DNA2,去离 子水补至50. PCR扩增条件:94?预变性4min,94?变性 1min,58?退火1min,72?延伸2min(30个循环), 72?延伸10min. 将PCR产物送至上海生工测序. 1.6.3同源性分析 将测序所得序列及GeneBank中获得的参比菌 株的16SrRNA基因序列经ClustalX序列比对后,采 用MEGA4中的邻接法(Neighbour-joining)进行系统 发育树的构建,自展值(bootstrap)为1000. 2结果 2.1乳酸菌生理生化鉴定结果 从15份酸奶子中共分离鉴定了71株乳酸菌, 包括32株球菌和39株杆菌.按照I.5所述的方法 和项目进行鉴定,发现杆菌都为乳杆菌属(Lactoba. cillus),球菌涉及肠球菌属(Enterococcus),链球菌属 (Streptococcus),乳球菌属(Lactococcus)和明串珠菌属 (Leuconostoc).其生理生化鉴定结果列在表1中. 2.216SrRNA基因序列分析 选取各类群的代表菌株和生理生化鉴定中没鉴 定到具体菌种的菌株共28株,提取其基因组DNA, 扩增其16SrRNA基因序列,进行测序.将16SrRNA 基因序列在GeneBank中进行同源序列搜索,发现各 受试菌株与标准菌株的同源性都在99%以上. 为显示供试菌株与已知菌种之问的亲缘关系及 其系统地位,按照1.2.5的方法进行同源性分析,结 果见图1. 2O山东大学学报(理学版)第43卷 项目项目球菌菌群 肠球菌链球菌乳球菌明串珠菌 注:”,/一”是指阳性菌株数目/受试菌株总数;球菌碳水化合物发酵项目较少,空 格表示没有测定. 2.3分离菌株的综合鉴定结果 总体来说,16SrRNA基因序列鉴定结果能较好 地与生理生化结果相吻合.26株生理生化鉴定为 Lb.helveticus的菌株,经16SrRNA基因序列分析结 果再次得到证实;10株Lb.册en册中,有4株生 理生化鉴定结果与标准菌株完全相符,另有6株菌 结果与.册em啪相近,个别项目不符,且这6 株菌的16SrRNA序列分析结果都为Lb.珊em啪, 同源性都在99%以上,综合鉴定这10株菌均为. fe,~ntu,n;生理生化鉴定结果为Lb.plantarum的3 株菌都可以在45?条件下生长,这点与Lb.planta. 的模式株不符,有1株菌的糖发酵结果与. plantarum模式菌株完全相符,另2株菌各有1种糖 发酵结果与模式菌株不一致.16SrRNA基因测序 结果表明这3株菌与Lb.p抛兀肌和Lb.pentosus 同源性都在99%以上,但与Lb.pentosus更接近,而 3株菌的糖发酵结果与Lb.pentosus模式株有2,4 项不一致.综合看来,这3株菌仍属于Lb.planta. 兀肌0 将乳酸球菌鉴定到属,两种鉴定方法得到的结 果一致.肠球菌属,包括4株E.durans,另有3株 肠球菌两种鉴定方法都不能区分其为E.durans或 E.hirae;链球菌属中,8株为S.thermophilus,2株为 S.bov/s,生理生化鉴定结果与16SrRNA基因测序 鉴定结果完全吻合;乳球菌属的2个菌株均为乳酸 乳球菌乳酸亚种(Lc.1actissubsp.1actis),生理生化 第7期赵蕊,等:新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析21 鉴定结果与16SrRNA基因测序鉴定结果完全一致. l广StreptococcusthermophilusX59028 83LKLDS3.O6O6EU419603 100LKLDS3.0603EU419602 --—-??---—--—— EnterococcushermanniensisAY396047 — 厂眈roc0cc?4 J肪嘲AJ276355 97LKLDS6.0601EU419600 57IKLDS1?O6Or7EU41959r7 60JLactobacillusm0sD79211 . !ocillparaplantarumAJ306297 【do矗p,忱nmD79210 L——————一厶.6口d瑚,I.asABoo5893 49广————一LactobacillusgastricusAY253658 L—Lactobacillusm??eAF126738 广一LactobacillusingluvieiAF333975 38]JKLDS1?o6o4EU419590 100ILactobac///us扁m删MmAJ575812 97lKLDS1.0603EU419586 99IIZnheh~t/cusAM113779 55JL—LactobacillusgallinarumAJ242968 L—以ocM,lemAY253660 L—一LactobacillacidophilusM58802 98ILeuconostocmesenteroidesA13023242 97KLDS5.0606EU419608 I..........一 O.O1 1oo lruconoatocpseudontesenteroidesAB023237 93LKLDS5.0601EU419604 99[LeuconostocholzapfeliiAM600682 lLLel’corInstocc由re’,nAB022923 100IrLeuconostocargentinumAF175403 1LeuconostoclactisAB023968 96.KLDS5 .O6o4EU4196O6 图1根据16SrRNA基因序列绘制的系统树 Fig.1PhylogenetictreebasedOilthe16SrRNAgenealignment.Bar,0.01sequencediverge nce 明串珠菌属内多个种之间碳水化合物发酵特征 十分相似,单纯依据生理生化指标,很难鉴定到种. 13株明串珠菌中,有7株菌用两种鉴定方法得到同 样的结果,包括:3株肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(. mesenteroidessubsp.dextranicum),3株乳明串珠菌 (Ln.1actis),1株假肠膜明串珠菌(Ln.pseudomesen. teroides).余下的6株明串珠菌都是生理生化鉴定 结果不能与某一具体菌种完全相符:1株难以区分 为阿根廷明串珠菌(Ln.argentimum)或乳明串珠菌 (各有1项不符),2株不能区分其为假肠膜明串珠 菌或肠膜明串珠菌(各有1项鉴定项目不符),另有 3株不能区分其为假肠膜明串珠菌或是阿根廷明串 珠菌(分别有2项和1项鉴定结果不符).对这些菌 做进一步的16SrRNA基因序列分析表明,生理生化 鉴定中怀疑是阿根廷明串珠菌的菌株,其16SrRNA 序列与乳明串珠菌更接近,因此将其鉴定为乳明串 珠菌;其余的5株16SrRNA序列与假肠膜明串珠菌 更为接近,因此将其鉴定为假肠膜明串珠菌. 3讨论 3.1鉴定的方法与可靠性 生理生化鉴定结果本身具有不确定性,加之有 些菌种生理生化性质相近,单纯用传统的表型分类 及糖发酵实验难以区分,还必须依靠分子鉴定手段, 一 般来说菌株间的16SrRNA相似性>97%,可能属 于同一个种;16SrRNA基因相似性高达99%以上, 可能属于同一亚种.因此,将生理生化鉴定与16S 山东大学学报(理学版)第43卷 rRNA基因测序的结果结合起来,才能够较准确地做 出鉴定. 当几种菌亲缘关系很近时(如一个种的亚种之间 或同一菌群内的不同菌种间),生理生化指标,与16S rRNA分子鉴定结果不一致时,有必要进行细胞全蛋 白的SDS.PAGE和AP-PCR等分子手段的分析l1引. 3.2生长温度的问题 根据文献[10,11]发酵乳杆菌在15o【=不生长, 但试验的结果却是10株发酵乳杆菌中有8株可以 ?生长.与此类似,植物乳杆菌在45o【=不应 在15 该生长l1J,但试验结果却是3株植物乳杆菌都可 以在45o【=生长.这可能与分离菌株的适应能力增 强有关.由于牧民家庭制作的乳及乳制品往往存放 在自然环境中,温差变化大,菌株经过长期的适应, 形成了这种在广泛温度范围内生长的特性l1引. 3.3酸奶子中乳酸菌多样性的分析 分菌时根据菌落,菌体形态从同一样品中分出 许多不同的菌株,生理生化鉴定发现这些”不同”的 菌都归于同种菌,但彼此间生理生化特性可能略有 差异.它们可能是同一样品中不同的菌株,也可能 是同一菌株对某些碳水化合物利用结果的不确定性 造成的.传统发酵乳制品常常是混合菌株发酵,这 对抵御噬菌体的污染也起到重要的作用,因此有必 要研究,开发这些菌株,制成多菌株的混合发酵剂. 采自新疆伊犁的15份酸奶子中,只有2个样品 (2006,2016)没有分离到乳杆菌,而且在分离这2 个样品时都曾分离到肠道菌;有3个样品(2017, 2019,2o28)中没有分离到乳酸球菌,但只有2017 曾分离出非乳酸菌;另有10个既分离出乳杆菌,又 分离出乳酸球菌的样品,只有2个样品(2015, 2020,2021)从中分离到非乳酸菌,说明乳杆菌对肠 道菌有一定的抑制作用.对于没有分离出球菌的样 品,可能因为球菌的耐酸性能不如杆菌.由于采集 的样品有些已经发酵了几天,pH值已经降到很低, 这对于乳酸球菌的生长存活很不利,造成菌体的死 亡或活性下降,因此当分离时不能有效地分离出来. 分离鉴定的71株乳酸菌,涉及到乳品中常见也 是发酵工业上常用的乳酸菌.乳杆菌属中,尽管只 分离鉴定出3种乳杆菌,但它们分别代表了专性同 型发酵,兼性异型发酵或专性异型发酵3种发酵类 群,且都能发酵乳糖.培养法得到的结果表明,瑞士 乳杆菌为酸奶子中的优势菌,在酸奶子的发酵中起 重要作用.发酵乳杆菌,尤其是植物乳杆菌能够利 用松三糖,蜜二糖,棉籽糖,纤维二糖这些人体难以 利用的寡糖. 乳酸球菌中,明串珠菌分离株无论在种类还是 在数量上都占优势,可能正是它们赋予了酸奶子优 良的风味和质地. 分离鉴定的乳球菌菌株无论是种类还是数量都 很少,这可能与酸奶子较低的pH值有关,致使乳球 菌生长受到抑制,活性也不高,不能在分离培养基中 很好的生长. 链球菌中,除了有在乳品中常见的嗜热链球菌, 还分离到牛链球菌,该菌有一定的致病性,说明传统 乳制品含有一些不良因素,在今后的开发利用中要 扬长避短. 孟和毕力格,张和平等人曾研究了新疆酸马奶 中乳酸菌的多样性I4],发现.helveticus为优势菌 种,并且也分离到Lb.plantrum和Lb.斥批啪,这 点与本试验的结果相同. 3.4研究方法的局限性及改进的方向 我国现有的对传统乳制品中微生物的多样性分 析都是采用传统的培养法(culture.dependent),然而 许多情况下某些细菌由于其活力不够或不可在分离 培养基中生长,不能被有效地分离,造成对环境微生 物多样性的低估l】.宜同时采用无需培养(culture. , independent)的分子生物学的方法,如PCR.DGGE法 直接从样品中抽提DNA,PCR扩增,再进行DGGE分 析,或是与已知的参照株比较,或是回收序列进行测 序,就可以知道样品中含有的微生物,如此可以更真 实地还原这些乳制品中微生物的多样性. 致谢:感谢师守信老师在生理生化鉴定过程中给予的指导和帮 助,感谢谷春涛老师在16SrRNA基因分析及构建系统发生树方面给 予的指导和帮助. 参考文献: [1]乌尼,敖敦格日勒,张爱荣,等.内蒙古牧区民族乳制品 的种类及制造工艺[J].内蒙古农牧学院学报,1996,17 (1):63—67. 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