【doc】氟尿嘧啶半乳糖化白蛋白微球的制备

【doc】氟尿嘧啶半乳糖化白蛋白微球的制备 氟尿嘧啶半乳糖化白蛋白微球的制备 中国药科大学 Journal.fChinaPharmaceuticalUniversityl999,30(6,:427,430427 氟尿嘧啶半乳糖化白蛋白微球的制备 徐希明傅志君朱小霞余江南张钧寿 (中国药科大学药剂学教研室,南京210009;镇江医学院药学系,镇江212001 镇江医学院附属医院化疗科,镇江212001) 摘要通过在氟尿嘧啶白蛋白微球的面偶联2亚氨基2甲氧基己基l一硫代一皿半乳吡喃糖苷,制蔷 了氟展嘧啶半乳糖化白蛋白微球(Fu—GBM)以糖密度,载药量为指标,考察了偶联反应时间,pH,反应比,超声分 散时间对制备工艺的影响制得的Fl】一GBM多呈规则的球形,粒径范围为035,217m,跨距为0.8O,平均粒 径0.90m糖密度为23.7,载药量为4.86 关键词氟尿嘧啶;半乳糖化白蛋白微球;制备工艺 寻求导向性强,效果好的靶向药物,一直是人 们致力研究的方向.药物靶向肝脏主要有两种方 式:微粒载体介导的被动靶向与无唾液酸糖蛋白 受体介导的主动靶向|_..无唾液酸糖蛋白受体存 在于哺乳动物的肝细胞表面,能特异识别末端带 有半乳糖残基或乙酰半乳糖胺残基的寡糖或寡糖 蛋白,并与之结合,故亦称肝细胞半乳糖受体 将半乳糖残基偶联到载药微垃的表面,形成半乳 糖化微粒,可具有主动与被动双重靶向性,实现更 高程度的药物肝靶向.基于此,我们首次尝试在氟 尿嘧啶自蛋白微球(RJ—BM)的表面偶联半乳糖,制 备氟尿嘧啶半乳糖化白蛋白微球(fluorouracfl galactosyl—BSA—micros口heres,Fu—GBM),以期利于氟 尿嘧啶(Fu)的肝脏转运. 1药品与仪器 2一亚氨基一2一甲氧基乙基一1一硫代一13-D一半乳吡 喃糖苷(IME一硫代半乳糖苷):自制;氟尿嘧啶自蛋 自微球(Fu—BM):自制;其余试剂均为分析纯; H66025超声清洗机(无锡超声电子设备厂); SORVALLSUPERT21高速冷冻离心机(美国Du Pont公司);pHS一2精密酸度计(上海雷磁); LABCONCO冷冻干燥机(美国);756MC型紫外可 见分光光度计(上海分析仪器总厂);Olympus显微 收精日期1999O8一l3江苏省科委社会发展基金资助项日 镜(日本);SX一0扫描电子显微镜(日本) 2实验 2.1Fu—GBM的制奋 IME一硫代半乳糖苷与牛血清白蛋白(BSA)的 反应参见文献]. 经过预试,Fu—GBM的制备工艺初步确定为: 准确称取Fu—BM100mg(1.47gmo1),用少量水润湿 后.加入l0ml含有IME一硫代半乳糖苷的硼酸缓冲 液(pH8.5),超声分散5min,室温下继续搅拌反应 一 定时间即得. 2.2Fu—BM固化温度的选择 分别以135?,150?,150?,175?为FuBM 的固化温度,将不同温度固化成的Fu—BM按前述 工艺制备Fu—GBM,扫描电镜观察形态,同时测定 DL,GD. 2.3糖密度对Fu肝脏靶向性的影响 准确称取1.47umol的Fu—BM5份,分别与 0.15,0.3,0.6,0.9,1.5mmol的[ME硫代半乳糖 苷偶联,制得不同GD的Fu—GBM. 取小鼠20只,随机分为5组,每组4只,尾静 脉注射相同剂量的Fu—GBM混悬液,15min后处 死,取肝脏,测定Fu,计算百分剂量(%dos~),考察 肝脏靶向性.小鼠肝脏中Fu的测定采用HPLC法, 428中国药科大学30卷 详细研究另文发表. 2.4Fu—GBM制备I艺的筛选 以糖密度(GD)>20,载药量(DL)为指标,筛 选制备工艺,考察偶联反应时间,反应pH,反应比 及超声分散时间对GD,DL的影响. 2.4.1偶联反应时间改变偶联反应时间t,每一 时间点取1.47{--~O1的Fu—BM,与1.47mmol的 IME一硫代半乳糖苷在pH8.5的缓冲液中偶联.分 别测定0.2S,0.5,0.75.1,3,6h下的GD与 DL. 2.4.2反应pl4取1.47um0l的FuBM与i.47 mmo]的1ME一硫代半乳糖苷,分别于pH为7.5, 8.0,8.5,9.0,l0.0的介质中偶联4Srain,测定GD 与DL. 2.4.3反应比取1.47tzmol的FuBM,加入不 同量的1ME一硫代半乳糖苷(以半乳糖计),使反应 比(Gal与FuBM的摩尔数之比)分别为:200:l, 400:l,600:l,800;1,1000:1,在pH8.5的缓 冲液中偶联,测定GD与DL. 2.4.4超声分散时间分取1.47umol的Fu—BM 四份,用少量水润湿后,加入0.88mmol的IME一硫 代半乳糖苷,分别超声2.5,l0,15rain.继续反应 4Srain,测定GD与DL. 2.5Fu—GBM冻干粉末的制备 Fu—GBM混悬液,经离心(15000r/rain),洗涤 后,加入5葡萄糖溶液作支架剂.一70c冻结后. 冷冻干燥,得FuGBM冻干粉末. 3结果与讨论 3.1FuBM固化温度的选择 改变固化温度所制得的Fu—GBM,其扫描电镜 图见罔1;DL与GD的测定结果见表1. Fjg1SEMphotographofFu—GBMprcparexlatdiff~entso]kl脚temperature (a)135?1(b)150?{(c)160?;(d)175? Tab1The敝【ofsolidifytemperatur~OnFuGBM固化温度不同,Fu—BM在偶联介质 中蚀解也 不同,固化温度越低,蚀解越严重,实验中发现, l35?固化成的微球偶联后大多微球塌解,l5Oc, 出现粘连,160c,175C时,则大多仍呈规则球形. 虽然l75c所得的FuGBM粒径比l60C的Fu— GBM小,但其DL与GD均较小,综合考虑Fu— GBM的形态与大小,DL,GD,我们仍以160~C固化 6期徐希明等:氟尿嘧啶半乳塘化白蛋白檄球的制备429 所得Fu—BM进行偶合条件的筛选. 3.2糖密度对Fu肝脏靶向性的影响 糖密度为偶联的半乳糖摩尔数与FuGBM摩 尔数之比.偶联前后半乳糖的量采用苯酚一硫酸 法【.不同GD对Fu肝脏靶向性的影响结果见图 2. 2EffectOfGD0nFu—GBMtargetingto]ive~ 图中可见,随着糖密度的增大,肝中蓄积增加, 这表明ASGP—R对配体的亲合与GD呈正相关], 当GD一19.0时,肝脏摄入趋于饱和,有研究表明, 20,30的糖密度已能保证肝细胞的最佳摄取", 我们以GD~>20为前提,尽可能提高DL,以此筛选 制备工艺. 3.3偶联反应时间的影响 采用不同偶联反应时间t,测得的GD与DL 见图3.由图可见,随着时间的延长,GD增加,反 应0.75h趋于完全;DL则随时间延长而下降,与 偶联前相比,反应1.0,3.0,6,0h药物分别洗脱 32.1,38.8,43.8.综合GD和DL,我们选择 反应时间为45mira. 0 0 Fi$3TheeffectofreactiontimeonGDandDL 3.4反应pH的影响 不同pH介质中测得的GD与DL结果见图4. 图中可见,随着pH的增大,GD上升,而DL下降, pH为9,10时,尽管GD达到24.4,26.8,但药物 洗脱率达40.4,53.6.我们选择pH=8.5的硼 酸缓冲液作为偶联介质. Fig4.Ttieeffect0ft0n(3D蛐dUL 3.5反应比的影响 采用不同反应比,测得的GD与DL见图5.图 中可见,反应比对Fu—GBM的载药量几乎没有影 响,随着反应比的增加,GD逐渐增加,至600:l 时,GD趋于稳定.我们选择600:l为反应比. FigbTheeffectofIeac?0nratioor[GDandDL 3.6超声分散时问的影响 不同超声分散时间测得的GD与DL见图6. 图中可见,超声时间延长,GD随之增大,但DL 显着下降,我们选择超声时间为5mira. 练上,Fu—GBM的优化制备工艺为:取100mg FuBM,用少量水润湿,加入10ml0.88mmol/L 的IME一硫代半乳糖苷硼酸缓冲液,超声分散5 min,室温下,继续搅拌反应45man,得Fu—GBM混 悬液. 依此工艺制得的Fu—GBM多呈规则的球形,粒 430中国药科大学30卷 径范围为0.3,2.17m,跨距为0.80,平均粒径 0.90Ltm,糖密度为23.7,载药量为4.86. Fig6.Theeffectofultr~nificatJontJ1]3e0nGDandDL 此外,FuGBM的冻干粉末.其扫描电镜特征 与粒径大小,DL与冻干前相比无显着变化,再分 散性良好, 参考文献 S0…MJDesou~PSitesp~inemieroenedpsulateddrug targetings?a嘲】一llv对andBasu0intestinaltg~cttargeting Adv,1995,17:247 2A]temannE,GurnyR.I~2,e]kerEDrug[~dednanopartJtc~ preparationmethodsanddrugtargeting…dPha~r, 坤一,1993SS(5):173 3VeraDR?StadathikRC,KrolmKA2"echnetium99mGalactc~yt neoglycOatbuminPrep~ationandpreclinJcalstudJ~.J^Med. 1985.26(10):1157 4LeeYC-StoweJJCP.a:antzMJ.2imino2methoxyethyt1 thioslycosid~,1976,I5t18):3956 5DuboisM.Gill幅KA.Hamilt0nJK,CoioTimet/Jcmethylfor deLeL~iftatiorlofsuEarsandrelatedsuhn…r0.1956 2B350 6VetaDR.K:ohnKA,StadatnikRC.fdFc99mga[act~yl neogtycoatbumin-invio'ocharac—u0nofreceptormediated biadiagJNm".1984.2St7)779 7StandatnikRC,VeraDR.WoodteEs.99mTcNGAfunctional hepaticimaging:prelimirtaxyclinicalexperience.JNadMeg, 1985.2B:1233 PreparationofFluorouracilGalactosylAlbuminMicrospheres XuXiming,FuZhijun,ZhuXiaoxia,YuJiangnan,ZhangJunshou DepartmentofPharmaceolizs,(PharmaceuticalUnwersiLy,Nanji~g210009,fk? Pharmacy. ZhenjiangMedw.cdCollege,Zhenj~n0212001,2DeTxwtmentofChemotherapy,Aj雄 d}{0s啦I,z唧 MedwatCdtege—Zhenj~ang22001 AbstractFluorouracilgalactosylbovineserumalbuminmicrospheres(FuGBM)wereprepa redbycoupling2一 iminc~2-methoxyethyl1thio— galactose(1MEthiogalactose)onthesurfaceoffluorouracflbovineSerHlllalbumin microspheres(Fu— BM).Thegalactosedensity(GD)anddrugloading(DL)wereselectedtoevaluatetheFuGBM formulation.Theinfluenceofthereactiontime,pH,reactionratioofIME— thiogalactose/FuBM.and ultrasonificationtimeonpreparationtechnologywasstudied.Scanningelectronmicrograph sshowedthatm0of Fu—GBMwerespherica1.ThediameterofFuGBMrangesfrom0.35, 2.17lam.Thespanwas0.8O.GDand DLwere23.74.86,respectively. KeywordsFluorouracil}Galactosylalbuminmicrospheres:Preparationtechonology