反相高效液相色谱法分别测定银杏达莫注射液中双嘧达莫与银杏总黄酮的含量

反相高效液相色谱法分别测定银杏达莫注射液中双嘧达莫与银杏总黄酮的含量 反相高效液相色谱法分别测定银杏达莫注 射液中双嘧达莫与银杏总黄酮的含量 中国基层医药2007年8月第14卷第8期ChinJPrimMedPharm,Au,~ust2007,Vo1.14,No.8 反相高效液相色谱法分别测定银杏达莫注射液中 双嘧达莫与银杏总黄酮的含量 唐丽霞李恩敬 ? 药物与临床? 【摘要】目的建立反相高效液相色谱测定银杏达莫注射液中的双嘧达莫和银杏总黄酮含量的方法. 方法双嘧达莫采用Chromasil—C18(250mmx4.6mm,5m)柱;流动相:0.1%磷酸二氢钠溶液甲醇(25: 75),检测波长为290nm,银杏总黄酮采用Shimpack.CLCODS(250mm×4.6mm,5m)柱;流动相:0.4%磷酸 溶液一甲醇(50:50),检测波长为360nm,流速为1.2ml/min.结果双嘧达莫进样浓度在6.12,24.48/ag/ml 范围内线性关系良好,平均回收率为99.82%,相对差(RSD)为0.85%;银杏总黄酮进样浓度在0.0476, 0.1904mg/ml范围内线性关系良好,平均回收率为99.53%,RSD为0.69%.结论该法简便,快速,准确, 可用于银杏达莫注射液的含量测定. 【关键词】银杏达莫注射液;双嘧达莫;银杏总黄酮;色谱法,液相 银杏达莫注射液为银杏提取物与双嘧达莫混合制成的 灭菌水溶液的复方制剂,每毫升含银杏总黄酮应为0.91, 1.10mg,双嘧达莫应为3.6,4.4mg….近年来,已有高效 液相色谱法,荧光光度法分别测定双嘧达莫和银杏总黄酮含 量的报道|2.].但对双嘧达莫和银杏总黄酮的复方制剂的含 量测定方法报道的少,作者在此基础上,参照国家药品标准 WS-1000I~(胁0087).2002银杏达莫注射液含量测定项…, 通过实验建立了反相高效液相色谱法J,分别测定银杏达莫 注射液中双嘧达莫与银杏总黄酮的含量,现报告如下. 1仪器与试药 高效液相色谱仪LC-1OAT一紫外检测器spD-10~(日 本岛津公司);N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研 究所);HH数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂);电 子天平(上海民桥电子天平仪器厂).银杏达莫注射液(贵州 益佰制药有限公司.批号:040812);双嘧达莫对照品,槲皮素 对照品,山奈酚对照品,异鼠李素对照品(中国药品生物制品 检定所);甲醇为色谱纯;磷酸二氢钠,磷酸,硫酸均为分析纯. 2双嘧达莫的测定方法与结果 2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以 0.1%磷酸二氢钠溶液(用1:3磷酸溶液调节pH值至4.6)一 甲醇(25:75)为流动相;流速为1.0ml/min;检测波长为290 nm;进样量20l;柱温25?. 2.2供试液的制备精密称取双嘧达莫对照品适量,加 80%甲醇溶液制成每1毫升含15g的溶液2J,作为对照品 溶液.精密量取本品2ml,置50ml量瓶中,加80%甲醇溶 液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液. 2.3系统实用性实验分别取对照品溶液和供试品溶液, 按上述色谱条件,各进样20l,记录色谱图,按外标法以峰 面积计算,理论塔板数按双嘧达莫峰计算不低于2000,重复 进样5次,相对标准差(RSD)不得大于2.0%.结果明:本 法测定双嘧达莫含量的色谱条件可行,与银杏总黄酮峰及其 他杂质峰间的分离度良好. 作者单位:247000安徽省池州,池州市人民医院药剂科 2.4线性关系精密称取双嘧达莫对照品15.3mg,置100 ml量瓶中,加80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度,精密量取 2,3,4,5,6,7,8ml,分别置50ml量瓶中,加80%甲醇溶液 稀释至刻度,摇匀,作为各对照溶液.取上述各对照溶液20 l,分别注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定.以双嘧达 莫的浓度c为纵坐标,峰面积A为横坐标,绘制标准曲线, 回归方程为:C:0.22x10一A一0.31,r:0.9996.表明双 嘧达莫含量测定在6.12,24.48/ag/ml浓度范围内线性关 系良好. 2.5精密度试验将线性试验项下的18.36/ag/ml的溶液 在含量测定项下的条件下重复进样5次,峰面积分别为 8057171,8057186,8057191,8057201,8057209,平均为 8057191.6,RSD为0.34%. 2.6稳定性试验取含量测定项下样品溶液,分别在0,2, 4,6,8,10h内进样,记录色谱图,按外标法以峰面积计算本 品的含量,分别为0.3965,0.3972,0.3952,0.3977,0.3963, 0.3970(mg/m1),平均为0.3965mg/ml,RSD为0.25%. 2.7加样回收率试验精密量取本品2ml,置50ml量瓶 中,加80%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,测定本品的含量(结 果为0.7739mg).另精密量取上述本品2ml,分别置100 ml量瓶中,共9份.精密量取双嘧达莫对照品溶液(浓度为 0.1570mg/m1)4,5,6ml,分别置上述量瓶中,各3份,加 80%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,另取双嘧 达莫对照品39.7mg置100ml量瓶中,加80%甲醇溶液溶 解并稀释至刻度,精密量取2ml,置50ml量瓶中,加80%甲 醇溶液稀释至刻度,作为对照品溶液.量取供试品溶液,对 照品溶液各20l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外 标法以峰面积计算本法的加样回收率,结果见表1.结果表 明本法有良好的加样回收率. 2.8辅料干扰性试验取处方比例的空白辅料及银杏叶提 取物,照含量测定方法进行试验.结果表明:辅料不干扰本 法的测定,银杏总黄酮与主峰的保留时间相差很大,分离度 良好. 中国基层医药2007年8月第14卷第8期ChinJPrImMedPharm,AuguN200701.,.8 表1双嘧达莫加样回收率测定的结果(=9) 3银杏总黄酮的测定方法与结果 3.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以 0.4%磷酸溶液一甲醇(50:50)为流动相,流速为1.2ml/min, 检测波长为360nm.理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于 1500,重复进样5次,RSD应不大于2.0%. 3.2实验溶液的制备精密称取槲皮素对照品12mg,置 200ml量瓶中,加8O%甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,作为对 照品溶液,精密量取本品25mI,加入5%硫酸溶液15ml,加 8O%甲醇溶液2Oml,置水浴上回流4h,放冷,移人100ml 量瓶中,加8O%甲醇溶液冲洗并至刻度,摇匀,经0.45m 孔径的滤漠过滤,作为供试品溶液. 3.3系统实用性实验分别取对照品溶液和供试品溶液各 2Ol,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,其中最大的3 个高峰,按保留时间依次为槲皮素(Q),山奈酚(K),异鼠李 素(I),以外标法计算Q,K,I,以2.5OQ+2.59K+2.44I计 算总黄酮的含量.结果表明:样品图谱中槲皮素峰保留时间 为16.737min.山奈酚保留时间为30.620min,异鼠李素保 留时间为34.405min,3个主峰与相邻峰的分离度均大于 1.5.理论塔板数按山奈酚峰计算为11576.178,按异鼠李 素计算为11878.122,表明本色谱条件可有效分离银杏总黄 酮各成分峰,且柱效较高. 3.4线性关系精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素 对照品23.8mg,置100ml量瓶中,加8O%甲醇溶液溶解并 稀释至刻度.精密量取上述溶液2,3,4,5,6,7,8ml,分别置 1Oml量瓶中,加8O%甲醇溶液稀释至刻度,作为各对照溶 液,取各对照溶液2O"l,分别注入液相色谱仪,按上述色谱 条件测定,以银杏总黄酮的浓度C为纵坐标,峰面积A为横 坐标,绘制标准曲线,回归方程为:C=0.14×10A一 0.00196,r=0.9996,表明银杏总黄酮含量测定在0.0476, 0.1904mg/ml浓度范围内,线性关系良好. 3.5精密度试验将线性试验项下的142.8~g/ml的溶液 在含量测定项下的条件下重复进样5次,峰面积分别为 9821496,9821501,9821517,9821523,9821533,平均为 9821514,RSD为0.33%. 3,6稳定性试验取含量测定项下样品溶液,分别在0,2, 4,6,8,10h内进样,记录色谱图,按外标法以峰面积计算本 品的含量,分别为104.3,104.6,103.6,103,6,102.0,102.4 (mg/m1),平均为103,4mg/ml,RSD为0,99%. 3.7加样回收率试验精密量取本品25ml,加入5%硫酸 溶液15ml,加8O%甲醇溶液2Oml,置水浴上回流4h,放 冷,移人100ml量瓶中,加8O%甲醇溶液冲洗并至刻度,摇 匀,经0.45m孔径的滤膜过滤,测定本品的含量(结果为 5.45mg).另精密量取上述本品25ml,加入5%硫酸溶液 15ml,精密量取槲皮素标准液(浓度为1.142mg/rn1)5ml, 分别置上述样品中,共6份,加8O%甲醇溶液2Oml,置水浴 上回流4h,放冷,移人200ml量瓶中,加8O%甲醇溶液冲洗 并至刻度,摇匀,经0.45m孔径的滤膜过滤.精密称取槲 皮素对照品12.5mg,置200ml量瓶中,加8O%甲醇溶液稀 释至刻度,摇匀,作为对照品溶液.量取供试品溶液,对照品 溶液各2Ol,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法 以峰面积计算本法的加样回收率,结果见表2.结果表明: 本法有良好的加样回收率. 表2银杏总黄酮加样回收率测定的结果(:6) 3_8辅料干扰性试验取处方比例的空白辅料及双嘧达 莫,照含量测定方法进行试验,结果表明辅料及双嘧达莫不 干扰本法的测定. 4讨论 本文建立的RP—HPLC法对银杏达莫注射液进行含量 测定,由于银杏达莫注射液为复方制剂,所以要对银杏总黄 酮和双嘧达莫分别进行含量测定.双嘧达莫是黄色弱碱性 药物,故无法采用2000年版中国药典的比色法检测;参考文 献[2.]报道了仅测定其中一种的含量,对银杏莫注射液中的 双嘧达莫和银杏总黄酮分别进行方法学验证,两者的线性关 系,精密度试验.稳定性试验,加样回收率试验均良好.辅料 对含量测定也无干扰,且双嘧达莫和银杏总黄酮峰之间分离 度良好. RP—HPLC法简便,快速,准确.为银杏达莫注射液的含 量测定提供了一种检测方法. 参考文献 1国家药典委员会.国家药品标准.化学药品地方标准上升国家标 准:第一册,2002:213. 2黄雪梅,英光剑,郭瑰春,等.反相高效液相色谱法测定双嘧达莫 的血药浓度中国医院药学杂志,2003,23(11):668. 3张敏,邱朝辉,曹庸,等.荧光光度法测定银杏叶总黄酮含量的研 究.时珍国医国药,2005,16(13):238. 4方子季.许自明,朱秀美,等.高效液相色谱内标法测定银杏叶制 品中的总黄酮含量.解放军药学,2002,18(1):51. 5中国药典.二部,2000:附录VD. (收稿日期:2007—04—04)