女性年龄对卵母细胞纺锤体和染色体构型的影响

女性年龄对卵母细胞纺锤体和染色体构型的影响 女性年龄对卵母细胞纺锤体和染色体构型 的影响 中华医学遗传学杂志2007年2月第2,4卷第1期ChinJMnet!)m!:丝!:! 女性年龄对卵母细胞纺锤体和 染色体构型的影响 陈雯胡娟刘群魏玉兰朱桂金 【摘要】目的探讨女性年龄对卵母细胞纺锤体和染色体构型的影响.方法取试管婴儿术后卵龄 l天的未受精卵母细胞,采用免疫细胞化学和激光共聚焦术检测卵母细胞纺锤体和染色体构型.结果 25—29岁女性卵母细胞I级纺锤体和染色体比率分别为33%和3l%,显着高于3o一34岁(P<0.05)和35 — 40岁女性(P<0.01);而25—29岁女性卵母细胞的?级纺锤体和染色体率均为54%,明显低于3o一34 岁(P<0.01)和35—40岁女性(P<0.05).结论卵母细胞纺锤体和染色体构型异常率与女性年龄存在 明显的相关性. 【关键词】卵母细胞;纺锤体;染色体构型;女性年龄 Influen~0fnmlernalageOnln@iG~csI,砌leandchromosomeconligm~lionofoocytesCHENWen,HUJuan, LIUm,WEIYu-lan,ZHUC.ui-jin.(DepartmentofGynecologyandObstetrics,rong,iHospit alofTon#Medical College,HuazlwngUniversityofScienceandTedmology,Wulum,Hubei,430030P.R.Chin a.Email:chentoenyyy @yahoo.com) [Abaraa】 ObjectiveTostudytheeffectofmaternalageOilmeioticspindleandchromosomeconfigurationof oocytes.MetlmdsSpindleandclm,mosomeconfigurationwasexaminedinday1unfel~lizedhumanoocytesafter/n t/frofertilization(rw)andintracytoplasmicsperminj~tion(ICSI)byimmunocytochemistryandvisualiTedbylasercon- focalmicroscopy.ResultsStatisticallysignificantdiffe~nceswereobservedonnormalspindleandchromosomeconfigu- rationsofoocytesbetween25— 29maternalagegroup(33%and31%,respectively),and30-34agegroup(P<O.05) aswellas35-40agegroup(O%.P<0.01).Theincidenceofabnormalspindleandchromosomeconfigurationsof oocy~sn30-34and35~10mammalagegroupswasmuchhigherthanthatofoocytesfrom25-29agegroup(P< O.Ol,P<O.05).CondusimlIncidenceofabnormalspindleandchromosomeconfigurationofoocytesisrelatedtOma. temalage.Itcouldbeanimportantn加ofagemimedoocyteaneuploidy. 【Keywordsl00cyte;spindle;cb10r?呲configuration;n~ernalage 年龄是影响女性生殖能力的一个重要因素.在体 外受精.胚胎移植(vitrofertilization-embryotl~ingfer, ?F.ET)中,随着女性年龄的增加,可募集的卵泡数和 获卵数明显下降,妊娠率降低,流产率则明显增高.然 而,高龄妇女接受赠卵后,其妊娠率和流产率均与年轻 女性无异,提示高龄女性生殖能力的下降并非基于子 宫因素,而是源于其卵母细胞的质量降低…1.近来对 卵母细胞的遗传学研究发现,女性年龄与卵母细胞非 整倍体间存在相关性,随着年龄增加,卵母细胞同源染 色体不分开和姐妹染色单体非平衡性早分离的发生率 也明显增加L2j.目前关于年龄与卵母细胞非整倍体相 关性的发生机理尚不清楚. 纺锤体是卵母细胞的重要组成部分,对于卵母细 胞染色体的平衡,运动,分离和极体的排出具有重要作 产科 作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院妇 ? 论着? 用.纺锤体异常,可导致减数分裂异常,产生非整倍体 卵子.我们采用免疫荧光化学技术,研究不同年龄女 性卵母细胞纺锤体和染色体构型的差异,以了解年龄 对于卵母细胞纺锤体和染色体构型的影响,探讨年龄 与卵母细胞非整倍体相关性的可能发生机理. 1材料与方法 1.1人未受精卵母细胞获取取2005年5月至l0月 我院生殖中心女性不孕患者?F和单精子卵细胞胞浆 内注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)术后未能 受精成功的成熟卵母细胞作为研究对象.采用我科常 规长进行促排卵,于前次月经周期的第2l,23 天,隔日1次皮下注射曲普瑞林(达必佳瑞典辉凌公 司)0.1nag进行垂体降调节,月经第3天用促性腺激 素(gonadotrophin,Gn)诱发排卵,当最大卵泡平均直径 达17,18am,注射绒毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotropin,hCG)10000U,36h后阴道B超指导下采 中华医学遗传学杂志2007年2月第24鲞箜翘丛!!!:丝:!:! 卵,采卵后4,6h行?F.ET或ICSI.授精16,18h后 胞浆内未见原核,卵周隙内仅见第一极体时确定为未 受精卵母细胞.在行ICSI时,若发现卵母细胞处于生 发泡期(germinalvesicle,GV),则将其继续培养至生发 泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD).所有获取 的卵母细胞均获得了患者的知情同意. 1.2免疫荧光细胞化学免疫细胞化学参照Picker. ing等[]的方法进行.去除透明带后,将人未受精卵母 细胞移入2%甲醛和0.o2%TritonX.100混合液中, 37~C固定和透化胞膜30min,转入a.微管蛋白单克隆 抗体(购自武汉博士德公司)中,工作浓度为1:100, 37~C孵育45min.二抗为异硫氰酸荧光素(FrI?)标记 的羊抗鼠IgG(购自北京中山生物技术有限公司),工 作浓度为1:100,37~C避光孵育45min.最后将卵母细 胞移入50t,g/mL碘化丙锭(propidiumiodidePI,美国 Sigma公司)中复染15min,整装压片,在激光共聚焦显 微镜下观察纺锤体和染色体形态分布并摄片. 1.3结果纺锤体和染色体分级参照Boiso等_4J 的.纺锤体分为3级:I级为正常纺锤体,纺锤体 为两极对称的桶形;I1级为纺锤体轻度异常,纺锤体极 性轻度异常或纵轴上微管减少;m级为纺锤体极性完 全消失或纺锤体阙如;染色体构型分3级:I级为正常 染色体,染色体紧密排列在赤道板上;I1为轻度异常, 个别染色体从赤道板上脱落;m级为染色体完全失去 正常的紧密排列结构,表现为松散分布,凝结成块,模 糊不清或阙如(图la,f). 1.4统计学方法采用检验,以P<0.05作为差 异有统计学意义的标准. 2结果 2.1卵母细胞的分期及检测结果为了避免卵龄对 卵母细胞纺锤体和染色体的影响,仅取1天卵龄(day 1,D.)的未受精成熟卵母细胞.共收集来自27名患者 (年龄25,40岁)的96个未受精成熟卵母细胞,其中 I级,?级和?级纺锤体数分别为19个(20%),10个 (10%)和67个(70%);I级,?级和?级染色体数分 别为17个(18%),11个(11%)和68个(71%). 此外,为了解第一次减数分裂中期(metaphaseI, MI)的纺锤体构型,还收集了ICSI术时16个未成熟 的GV期卵母细胞,培养至GVBD.行免疫细胞化学 后,3个细胞处于实际的分裂中期,另13个细胞处于 分裂后期的不同阶段.3个实际的MI卵母细胞分别 ,纺锤体和染色体均 来自1名32岁和1名33岁患者 为?级. 2.2女性年龄对卵母细胞纺锤体和染色体的影响 根据女性年龄不同,将Dl卵母细胞分为3组:第1组 45个卵母细胞,来自11名25,29岁女性,平均年龄 (27.1?2.3)岁;第2组33个卵母细胞,来自9名30, 34岁女性,平均年龄(33.2?3.4)岁;第3组18个卵母 细胞,来自7名35,40岁女性,平均年龄(37.1?3.2) 岁,纺锤体和染色体结果见表1,2.在25,29岁女性 的45个卵母细胞中,I级纺锤体和染色体比率分别为 33%和31%;在30,34岁女性的33个卵母细胞中,I 级纺锤体和染色体率仅为12%和9%,明显低于前两 者(P<0.05);来自35,40岁女性的18个卵母细胞中 未见I级纺锤体和染色体.3组间的?级纺锤体和染 色体率无明显差异.?级纺锤体和染色体率随年龄增 加而明显增加,35,40岁女性卵母细胞的?级纺锤体 和染色体率分别高达94%,30,34女性卵母细胞的? 级纺锤体和染色体率也高达79%和78%,均明显高于 30岁以下女性(P<0.01,P<0.05).30岁以上女性 Dl未受精卵母细胞的纺锤体绝大部分表现为极性消 失,呈现一团杂乱的微管结构,染色体失去紧密排列的 构型,杂乱无章地散布于纺锤体中(图1c,d);部分卵 母细胞中未见染色体(图le)或微管结构(图lf).在1 名35岁和1名40岁患者的2个卵母细胞中还分别见 三极和四极纺锤体(图2). 表1女性年龄对卵母细胞纺锤体的影响 Table1EffectofmaternalageOnspindleconfigurationofoocytes c0哪mI划with25—29years(与25,29岁比较),a:Jp<O.05;b:Jp< 表2女性年龄对卵母细胞染色体的影响 Table2EffectofmaternalageOiichl'omos,omeconfigurationof oocvtes c0q,aredwith25?29years(与25,29岁比较),a:P<0.05;b:P< 3讨论 纺锤体是由大量微管纵向排列组成的中间宽两极 小的细胞器,与染色体运动密切相关.正常的纺锤体 ng?2n--"c【___l_I~hu11--l,l…一l_|t-?r1…【l…I.qirIIIII??-一一- …u『jI?』{1ljl:IIii~tl…'……IIg?|l(一11…|JLIII}h?0_…H}…lH4?_vl.II}~qliii ,『nh】IcI?…1tlI:1c…rllll_?'JrlI?I?_h1Ic.n) i ilt 手仃染色体挂确保减数分裂l常进什和染色体l}响 分离的父钰,之一在动物研究已1IE寅.】通休q-龄 增,卵母细胞的幼锤休黻常率叫{上升.H】『1约 钝J_勾片常可引起染也件常分离.导致俯 伴,同此,』斛人印母胞纺锤体铷随女忭年 龄的变化刈J刖叫年龄Hl一情体的发生机删lL 柯重要意义迄令为止,父丁女l生年龄凡母细胞 纺锤体椰染色伴构型芙系的研究擞少.?结不 c"3i'limi:k~II H等埘10,15_l40—45岁年龄段广_ 然胤期女的印叫胞世f,r结llI=J阿 年龄段训的圳胞约铺怵和包怍J仔圳 衅】在wm等的研究-斤术垃珊戈比1=龄纺 钝怍构型棚荧』进_解几母细他纺铖 体I染包伴掏型0年龄均咒乐.我们舒折』.25, 加岁奠圳J胞纺铺伴染邑f蚰况,,i:将 其分为1』,,30,j4以醍35,40j年龄 一 中华医学遗传学杂志2OO7年2月第24卷箍塑塑型!—J 层次进行了探讨. 本研究结果表明30,34岁女性卵母细胞的I级 纺锤体和染色体率明显低于30岁以下女性,而?级纺 锤体和染色体率则分别达78%和79%,显着高于后 者;在35岁以上女性,这一趋势更为明显,?级纺锤体 和染色体率达到94%,而且出现多极纺锤体,提示卵 母细胞纺锤体和染色体构型异常率与女性年龄存在明 显的相关性,随女性年龄增加而明显上升.纺锤体组 装和染色体排列异常的增加将导致减数分裂中的错误 发生率随之上升,这可能是引起高龄女性非整倍体率 增高的重要原因之一. 由于伦理学原因,我们使用的是D.未能受精的卵 母细胞,而且其来源于接受了促排卵治疗的不孕女性. 促排卵药物和采卵过程中的机械刺激对卵母细胞纺锤 体和染色体构型的影响尚不清楚,因此这种离体卵母 细胞纺锤体和染色体构型异常率可能高于体内新鲜的 卵母细胞和正常受精的卵母细胞,但由于不同年龄组 均采用的是这种Dl未受精卵母细胞,因此各年龄组的 纺锤体和染色体异常率仍具可比性.与通常的35岁 分界点不同,我们发现30岁以上女性卵母细胞的纺锤 体和染色体异常率就已显着增加.下一步应对大样本 的新鲜卵母细胞进行检测,以验证这一结果. 除了观察到第二次减数分裂中期(metaphaseII, M?)纺锤体和染色体构型外,我们还检测到了MI期 的纺锤体和染色体构型.MI并非是细胞周期停滞 点,而是一个短暂的过程,难以捕捉.在30岁以上女 性的3个MI卵母细胞中发现了中期纺锤体和染色 体,3个卵母细胞中均见?级纺锤体和染色体.尽管 细胞数量有限,但这一结果仍提示M工期的纺锤体和 染色体构型异常与M?期类似. 此外,本研究结果对于临床上实行补救ICSI具有 一 定的指导意义.近年来,ICSI被成功用于常规?F 中未受精卵的再受精,称为补救ICSI,各中心报道补救 ICSI受精率可达28%,60%[.尽管受精率尚可, 但补救ICSI后的妊娠率极低,而且对D.卵母细胞来 源胚胎的细胞遗传学研究显示其染色体异常率高达 50%,100%【mJ.本研究结果中25,29岁女性D1卵 母细胞中的正常I级纺锤体和染色体率仅为33%和 31%,而在30,34岁和35,40岁女性Dl卵母细胞中, 正常工级纺锤体和染色体率降至9%,12%和0,这一 结果与上述D.卵母细胞来源胚胎的高染色体异常率 相一致[10].因此,我们认为实行补救ICSI的意义有待 进一步商榷,尤其是对于30岁以上女性,鉴于其D1卵 母细胞较高的纺锤体和染色体构型异常率,不宜实行 补救ICSI. 参考文献 lNavotD,DrewsMR,PA,da/.Age-relateddeclineinfemalefer? 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(收稿13期:2006-03-27) (本文编辑张丽玲)