乌司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

乌司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用 乌司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠肺缺血 再灌注损伤的保护作用 1616 ? 基础研究? 重庆医学2011年6月第4O卷第16期 乌司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用 郭亮,唐忠志,程青,邬明,曾趁枚,韩璇,杨李 (广州军区武汉总医院:1.急诊科;2.医学实验科,湖北武汉430070) 摘要:目的探讨鸟司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠肺缺血再灌注损伤时血清水通道蛋白一1(AQP1)及肿瘤坏死因子 (TNF-a)的影响.方法将4o只Wistar大鼠随机分为5组(一8):正常对照组,模型对照组,甲基泼尼松龙组(30mg/kg),乌司 他丁组(50000U/kg)及联合治疗组[甲基泼尼松龙(30mg/kg)联合乌司他丁(50000U/kg)].采用ELISA法检测血清AQP1 和TNF-a水平;考马斯亮蓝法检测肺泡灌洗液中蛋白质含量;检测肺湿/干质量并对肺进行形态学观察.结果与模型对照组相 比,乌司他丁组或甲基泼尼松龙组血清AQP1质量浓度明显增加,而TNF_a质量浓度明显降低,联合治疗组血清AQP1与 TNpa的改变更为明显(P<0.01);乌司他丁组,甲基泼尼松龙组及联合治疗组的肺泡灌洗液中蛋白质含量及肺组织湿/干质量 比值均明显降低(P<O.O1).结论乌司他丁联合甲基泼尼松龙对大鼠缺血再灌注急性肺损伤具有良好的治疗作用,其机制可 能与提高血清AQP1水平及降低TNF"水平有关. 关键词:再灌注损伤,肺;乌司他丁;甲基泼尼松龙;水通道蛋白;肿瘤坏死因子a doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2011.16.023文献标识码:A文章编号:1671—8348(2011)16-1616—03 Protectiveeffectsofulinastatincombinedwithmethylprednisoloneonpulmonaryischemiareperfusioninjuryinrats GuoLiang,TangZhongzhi,ChenQing,WuMing,ZengXianmei,HanXuan,YangLi (1.DepartmentofEmergency;2.DepartmentofMedicalLaboratory,WuhanGeneralHospitalof GuangzhouCommand,Wuhan,Hubei430070,China) Abstract:ObjectiveToexploretheinfluenceofulinastatincombinedwithmethy1prednisoloneonaquaporin1(AQP1)and tumornecrosisfactor-alpha(TNF-a)inserumwhenischemiareperfusioninjuryoccuredinrats.Methods40Wistarratswereran— domlydevidedinto5groups(n一 8):normalcontrolgroup,modelcontrolgroup,methy1prednisolonegroup(30mg/kg),ulinastatin group(50000U/kg)andcombinationgroup[ulinastatin(5O000U/kg)combinedwithmethylperdnisolone(3Omg/kg)].Levelsof AQP1andTNFainserumweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(EIISA);Proteincontentsinbronchoalveolar lavagefluidwereassayedbyCommassiebluestaining;Wetanddrymassweremeasuredbyscaleandpulmonarymorphological changeswereobservedbyoptica1microscope.ResultsComparedwithmode1controlgroup,serumconcentrationofAQP1was significantlyincreasedandthatofTNFudecreasedinulinastatingroupandmethy1prednisolonegroup,especiallyincombination group(P<O.01);Proteincontentsinbronchoalveolarlavagefluidandwet/drymassratioswerebothmarkedlyreducedinulinasta— tin,methylprednisoloneandcombinationgroups(P<O.01).ConclusionUlinastatincombinedwithmethy1prednis0loneadministra— tionhasbettertherapeuticeffectsonacutelunginjurycausedbyischemiareperfusioninrats,whichmechanismprobablycorrelated withincreasinglevelofserumAQP1anddecreasingthatofTNFR. Keywords:reperfusioninjury,pulmonary;ulinastatin;methylprednisolone;aquaporin1;tu mornecrosisfactor-alpha 肺缺血再灌注损伤是指肺移植,体外循环手术及创伤等导 致机体大量失血,造成肺缺血,在重新灌注后,肺缺血引起的肺 损伤不但没有减轻,反而加重的现象.临床上主要现为肺水 肿及急性呼吸衰竭.水通道蛋白(aquaporin,AQP)具有增加 细胞膜对水的通透功能,提供快速液体转运途径.肿瘤坏死因 子一?(tumornecrosisfactor-a,TNF—a)是缺血再灌注肺损伤时 最早释放的介质,它不仅能介导内毒素的多种生物学作用,还 诱导白介素(interleukin,IL)一6,IL一8等细胞因子的瀑布样释 放.乌司他丁具有抑制多种炎症介质和蛋白酶释放的作用,甲 基泼尼松龙作为抗炎药广泛用于临床,二者联用在急性肺损伤 中是否具有协同抗炎作用,目前尚不清楚.本研究旨在探讨缺 血再灌注诱导的急性肺损伤中,乌司他丁联合甲基泼尼松龙的 保护作用. 1材料与方法 1.1主要试剂注射用乌司他丁为广东天普生化医药股份有 限公司产品(批号:H19990134),甲基泼尼松龙由法玛西亚善 强公司(比利时)生产(批号:H20060054),APQ1和TNF_d酶 联免疫吸附测试(enzymelinkedimmunosorbnentassay, ELISA)试剂盒购自R&D公司(美国). 1.2动物分组与模型建立选择成年雄性Wistar大鼠4O 只,体质量2OO,250g,由湖北省实验动物研究中心提供,实验 动物合格证号:SCXK(鄂)2008—0005.将Wistar大鼠随机分 为5组:正常对照组,模型对照组,乌司他丁组,甲基泼尼松龙 组及联合治疗组(乌司他丁联合甲基泼尼松龙),每组8只.正 常对照组为假手术组,其余各组采用以下方法建立大鼠肺缺血 再灌注模型:骨钳致鼠一侧股骨中下1/3粉碎性骨折,经股动 脉放血(持续约lOmin)使平均动脉压降至(40--+5)mmHg,并 维持90min,经大鼠颈静脉回输全部失血与等量复方氯化钠复 苏,复苏30min后给予复方乳酸钠2.5mL?kg?h持续 泵注.药物治疗均通过颈静脉注射给药,乌司他丁组给予乌司 他丁50000U/kg,甲基泼尼松龙组给予甲基泼尼松龙30mg/ kg,联合治疗组给予乌司他丁5O000U/kg及甲基泼尼松龙3O mg/kg;模型对照组不注射药物. 1.3血清AQP1及TNF—a水平的检测在放血前,再灌注 2,4h时分别采集大鼠静脉血1mL,严格按照ELISA试剂盒 书检测血清中AQP1和TNF-水平. 重庆医学2011年6月第4O卷第16期 1.4肺泡灌洗液蛋白质含量的检测及肺湿/干质量(wet/dry mass,W/D)比值的计算再灌注4h后引颈处死大鼠,取肺组 织,用1mI生理盐水灌洗肺泡,收集肺泡灌洗液,采用考马斯 亮蓝法检测肺泡灌洗液中蛋白质含量.用滤纸吸去右肺上叶 血液,天平称量肺叶的湿质量,然后,置烤箱中(80?,20h)烤 至恒质量,称量干质量,计算肺W/D比值. I.5形态学观察肉眼观察肺大体改变,然后,取右肺下叶用 lo(体积分数)甲醛固定,石蜡包埋,切片,苏木素伊红(he matoxylJnandeosin,HE)染色,光镜下观察. 1.6统计学处理应用SPSS15.0统计软件进行统计分析, 计量数据以?S表示,组问采用方差齐性检验,两两比较采用 独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1各组大鼠血清AQP1和TNF—a水平的比较与模型对 照组对比,乌司他丁组,甲基泼尼松龙组及联合治疗组血清 TNF-a的质量浓度明显降低,差异有统计学意义(P<O.01); 联合治疗组TNF0t的质量浓度降低更明显,与乌司他丁组及 甲基泼尼松龙组比较,差异有统计学意义(P%0.01).与模型 对照组比较,乌司他丁组,甲基泼尼松龙组及联合治疗组血清 AQP1的质量浓度明显增加,差异有统计学意义(P<o.O1); 联合治疗组AQP1的质量浓度增加更明显,与乌司他丁组及 甲基泼尼松龙组比较,差异有统计学意义(P<o.O1).结果见 表1,2. 表1各组大鼠放血前及再灌注2,4h血清AQP1的 质量浓度比较(j:?S,ng/L,"一8) :P<O.o1,与正常对照组比较;?:P<20.O1,与同时间点模型对 照组比较;#:P<0.01,与同时间点联合治疗组比较. 表2各组大鼠放血前及再灌注2,4h血清TNF—a的 质量浓度比较(j?s,ng/I,一8) :P<0.01,与正常对照组比较;:P<0.01,与同时间点模型对 照组比较;:P%0.01,与同时间点联合治疗组比较. 2.2各组大鼠肺泡灌洗液中蛋白质含量和肺W/D比值的比 较模型对照组肺泡灌洗液中蛋白质含量和肺W/D比值显 着高于正常对照组(P<0.01),与模型对照组比较,乌司他丁 组或甲基泼尼松龙组的肺泡灌洗液蛋白质含量与肺W/D比 值显着降低(P<0.01),联合治疗组降低更为显着(P<0.01), 接近正常对照组水平(P>O.05).见表3. 2.3大鼠肺形态学的变化 2.3.1大体改变正常对照组大鼠双侧肺叶色泽,形态正常, 表面无出血点,胸腔内无渗出液;模型对照组大鼠可见双侧肺 1617 叶充血水肿,色泽呈暗红色,表面可见紫红色斑块,且胸腔内渗 出液呈淡红色;乌司他丁组或甲基泼尼松龙组大鼠双侧肺叶轻 度充血,表面呈淡粉红色,局部肺叶表面可见暗红色出血点,肺 叶弹性良好,胸腔内可见少量淡黄色稀薄渗出液;联合治疗组 大鼠较上述改变更轻微. 表3各组大鼠肺泡灌洗液蛋白质含量及肺W/D 比值比较(?S,一8) :P<O.Ol,与正常对照组比较;?:P%O.Ol,与模型对照组比较. 2.3.2病理改变正常对照组大鼠肺组织未发现病理改变; 模型对照组大鼠可见明显肺水肿,渗出液多,腔内可见红细胞, 毛细血管扩张,淤血,炎症细胞浸润;乌司他丁组或甲基泼尼松 龙组大鼠肺泡壁毛细血管扩张,淤血程度较模型对照组轻,部 分肺间质及肺泡水肿,肺泡腔内渗出物明显减少,少量炎症细 胞浸润.联合治疗组大鼠改变更轻微. 3讨论 在肺移植,人工心肺转流术,肺动脉栓塞栓子摘除术以及 机体大量失血等可导致肺缺血及再灌注损伤,其基本病理改变 为肺毛细血管通透性增加,继发肺水肿,使肺血管阻力增加和 气体交换障碍,一旦处理不当,可导致急性肺损伤,甚至多器官 功能障碍综合征,危及生命.失血性休克早期积极干预治疗, 避免严重并发症的发生是当前研究的重要课题.肺缺血再灌 注损伤的机制与细胞因子及其信号转导有密切关系.急性失 血时,产生大量的细胞因子,活性氧及蛋白水解酶,再灌注后这 些因子与活性物质通过体循环到达肺血管床,激活肺毛细血管 内皮细胞及中性粒细胞等,导致肺组织炎症".TNFn是缺 血再灌注肺损伤时最早释放的介质之一,除了直接毒性外,还 可激活损伤的粒细胞,内皮细胞及血小板等释放自由基与溶酶 体酶等介质对组织产生更广泛的损害效应[2;大量实验表明, 在急性肺损伤的发生发展过程中,肺组织局部产生大量促炎性 细胞因子(II一1,IL6,IL一8及TNF_a等),它们之间形成复杂细 胞因子网络,互相激活,互相作用,使炎症反应级联放大,导致 急性肺损伤的发生].因此,TNF能更好地反映急性肺损 伤炎症反应强弱及观测治疗效果. AQPs是调节进出细胞膜的水通道同源蛋白质大家族的 总称,它不仅参与生理状态下液体的转运,还可能与病理状态 下液体的转运失衡有关.在哺乳动物体内已被确认的AQPs 有11种,分布于肺组织中的有6种(AQP1,AQP3,AQP4, AQP5,AQP8及AQP9)[6j.其中AQP1位于肺毛细血管 内皮细胞,只负责转运水,不允许其他溶质和分子通过.与野 生型相比,AQP1敲除的小鼠肺泡一毛细血管间水的通透性是 野生型的1/10,AQP1促进肺内因渗透压改变引起的水的快 速转运. 大量研究已经证实糖皮质激素通过糖皮质类固醇激素受 体对多种信号通路发挥作用,早期小剂量应用甲基泼尼松龙可 缩短患者的缺氧和休克持续时间,并缩短机械通气时间_】. 同时短期应用甲基泼尼松龙可减少糖皮质激素引起的不良反 应,如避免诱发或加重感染,防止消化道出血等.乌司他丁是 l618 从人尿液中提取精制的糖蛋白,属蛋白酶抑制剂,能够同时抑 制胰蛋白酶,透明质酸酶,弹性蛋白酶等多种水解酶的活 性";另外,乌司他丁还能稳定溶酶体膜,防止溶酶体内的 水解酶外溢.因此,乌司他丁能够抑制炎症介质的释放,减少 嗜中性粒细胞向肺聚集,并抑制弹性蛋白酶对肺血管内皮细胞 的细胞间结缔组织的破坏,从而降低肺血管通透性和炎症反 应,抑制肺损伤,改善肺功能. 本研究结果显示,乌司他丁和甲基泼尼松龙都能明显降低 血清TNF—a水平,提高AQP1水平,联合应用的效果较单用 乌司他丁或甲基泼尼松龙作用更强,且能减少甲基泼尼松龙的 剂量.结果提示甲基泼尼松龙和乌司他丁联合用药可抑制炎 症介质的过度释放,改善微循环,组织灌注等,通过调控全身炎 症反应/C一反应蛋白来维持细胞内外水平衡,以保护受损肺组 织,但其具体作用机制还需要进一步研究?】l6l. 参考文献 SobueK,AsaiK,KatsuyaH.Aquaporinwaterchannels inthebrainandmolecularmechanismsofbrainedema [J].NipponRinsho,2006,64(6):1181一i189. 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