钙离子载体A23187对脐血来源EPC作用及应用蛋白质芯片检测蛋白质表达差异的研究（可编辑）

钙离子载体A23187对脐血来源EPC作用及应用蛋白质芯片检测蛋白质表达差异的研究（可编辑） 钙离子载体A23187对脐血来源EPC作用及应用蛋白质 芯片检测蛋白质表达差异的研究 学校代码: 学 号: 作用及应用蛋白质 芯片检测蛋白质表达差异的研究 : 所 院 微循环研究所 : 姓 名 王琴 : 指导教师 仉红刚教授 : 学科专业 生物医学工程 : 研究方向 生物芯片在血管新生及蛋白质 组学研究中的应用 : 完成日期 年月论文目录 中文摘要?.. 英文摘要?.. 第一部分:内皮祖细胞的体外培养?.. 前’言. 刖昌. 材料与方法?. 实验结果讨论 结论 需要进一步进行的研究.. 参考文献?.. 第二部分:芯片分析钙离子载体对于内皮祖细胞蛋白表达的影响?为 前言 刖吞 材料与方法? 实验结果?.. 讨论 结论 需要进一步进行的研究.. 参考文献?.. 文献综述:内皮祖细胞研究进展概述??.. 致谢??.. 个人简历?. 附:已发表论文及大会交流论文摘要??. 独创性声明及学位论文版权使用授予?..一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要 钙离子载体对脐血来源作用及应用蛋白质芯片检测蛋白质表达差异的 研究 研究背景:组织工程血管以及组织工程化组织的血管化因目前内皮种子细胞扩增能 , 力和生物活力的不足而受到限制。内皮祖细胞 是内皮细胞的前体细胞。并可被转移至外周血,参与缺血组织的血管重建和 血管的内膜化,因此有望成为今后组织工程内皮种子细胞的重要来源。为此, 有关的体外诱导培养、扩增和细胞增殖、凋亡的调控亟待深入研究,在细胞行 为调控中,钙离子是细胞生物行为的重要调控因子,当细胞内钙离子稳态失衡时, 会导致多种细胞异常行为发生,从而引发疾病。钙离子载体是一种高度选择 性的钙离子载体, 能与形成稳定的复合物,使胞外的透过细胞膜,生理性 或人为性地提高胞浆游离钙水平,有效增加细胞内 浓度,增高的作为第二 信使可促使蛋白激酶和其他钙依赖性蛋白激酶活化,并催化细胞内多种蛋 白质磷酸化,从而启动淋巴细胞活化、增殖。此外,还是氧化磷酸化的解偶 联体,抑制线粒体酶的活性,影响细胞代谓‘水平。 研究目的第一部分研究目的在于建立体外培养脐血来源内皮祖细胞的培养体系, 包括脐带血采集、单个核细胞分离、内皮祖细胞诱导培养、内皮祖细胞生长特性和 表型分析鉴定。第二部分研究目的在于利用移动性钙离子载体作用于内皮 祖细胞,观察其对内皮祖细胞的作用影响;以表面增强激光解吸离子化飞行时间质 ? /? 谱,工一?技术分析作用后的内皮祖细胞细胞内钙离 子浓度变化及其对细胞表型和细胞蛋白质表达谱的影响,探讨不同浓度及 引起的相应细胞内钙离子浓度变化对内皮祖细胞的调控机制和作用,为内皮祖细胞 调控机制和临床应用提供研究依据。 研究方法在第一部分中,经无菌采集后的脐带血,在小时内经密度梯度离心获 得单个核细胞,以本室已建立的内皮祖细胞培养体系培养,从脐血获得的单个核细 胞接种天后,分别选取贴壁细胞和悬浮细胞进行培养至第天后,观察两种方 法所获得细胞的形态及数量。对悬浮细胞进行培养,免疫细胞化学和流式细胞术对 培养天后的细胞进行内皮祖细胞相关细胞表型、、、, 鉴定,培养过程中,观察细胞生长状况并测定细胞生长曲线。在第二部分中,钙离 子载体以,,,岫/作用于培养至第七天的内皮祖细胞,作用 小时,后流式细胞术检测不同浓度作用下细胞内钙离子浓度变化,并且利一 一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 的表达量。采用 用流式细胞术检测不同浓度作用下 蛋白质芯片检测不同浓度作用下蛋白质差异表达情况:.?裂解 液进行蛋白质提取并利用法测定蛋白浓度;.蛋白活化点样;.芯片检测; .数据处理与分析。 研究结果第一部分中,经观察筛选,发现从脐血获得的单个核细胞接种天后, 分别选取贴壁细胞和悬浮细胞进行培养至第天后,观察两种方法所获得细胞 的 形态及数量。发现选取贴壁细胞进行培养,细胞总数较少为?,并且无梭形 样内皮祖细胞出现;相反,选取悬浮细胞进行培养,至第天时,细胞数量达? .,并且出现梭形样内皮祖细胞。故此,本研究选用悬浮细胞进行诱导培 养,其接种后前天为生长的潜伏期,细胞开始贴壁,无明显扩增。第天平均每 个视野下细胞数目为;第天细胞数为;第天开始,细胞进入对 数生长期,细胞数为.,与第天的细胞相比;第天细胞继续增 殖,细胞数为.,与第天的细胞相比;第天时,细胞进入凋 亡期,数量明显减少,为.,与第天的细胞相比。,, 表达阳性。流式细胞术结果表明,梭形样细胞群体中,阳性率为 .%.%.。阳性率为.%.%.。第二部分中,经 技术检测不同浓度组,结果显示共有个差异表达蛋白,其中个 高表达,个为低表达.。并且内皮祖细胞阳性率呈浓度依赖 性降低,并发现钙离子载体在浓度高至岬/时,有显著促进内皮祖细 胞凋亡作用。 研究结论经本研究建立的内皮祖细胞培养体系,能够自脐带血来源的单个核细胞 成功诱导培养出具内皮祖细胞形态特征的细胞,经细胞表型鉴定为内皮祖细胞。对 上述内皮祖细胞以钙离子载体作用,发现在低浓度时,抑制内皮祖 细胞向成熟内皮细胞分化;高浓度时,凋亡细胞数目增加,有浓度依赖性促进内皮 祖细胞凋亡,并且具有抑制内皮祖细胞向内皮细胞分化的作用。 待研究工作:对本研究中以技术检出的差异蛋白质点进行进一步分析,采用 二维凝胶电泳及质谱法对于差异表达蛋白进行鉴定。 关键词:内皮祖细胞;体外培养;细胞鉴定;表面增强激光解吸离子化飞行时间质 谱;蛋白差异表达一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 ? : 讪 舶 啪 . : 仃 仃 毋 . 锄:枷如’, . ,, ,, 巧 : ? .. ,“,? ”拶 .如培 ,、 虢,.,锄 印 . .: 锄 , , 眦 啪锄 . 弘 啪 ? ? 砌, 锄 . ., , 啪 .?. 撕 , .,?, ? , , ., . ? ., . , , 抛、? .%?. %., ?、? .%?.%. .“旧: ,’印聃, ’. 仃. : 眦: 讪一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 , , , . ; ., 唱 :’ ,旋 , , 锄 “. ’ :. 匆锄 . ; : ;;沁 仃 印? ?一一一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 前言 早期认为内皮祖细胞仅存在于胚胎发育阶段,之后的研究发现也存 在于成体。目『的研究结果认为,主要是胚胎的中胚层和出生后的骨髓来源的, 是一群能够最终分化为内皮细胞的多潜能细胞,这群细胞具有修复损伤内皮细胞功 能以及增强并进行组织缺血后的血管发生和血管新生 的作用“。年“等首先利用带有细胞表面标记物 和抗体的免疫磁珠从外周血单个核细胞纯化出了和细胞,并通过动物 实验证明这两种细胞均具有成血管能力,这一研究证明了成体外周血中亦存在具有 血管新生作用的内皮祖细胞。之后大量的研究表明,不仅存在于成体外周血中, 也存在于脐带血,骨髓,胎儿肝脏等‘圳。 近年的研究进一步发现,脐带血中除造血干细胞外还存在有与骨髓间充质干细 胞相似的,具有多向分化潜能的非造血成体祖细胞 ,,这类细胞可在体外培养扩增,并且能够分化为内皮细胞、成骨细 胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种组织细胞‘。。正由于脐带血干细胞 具有来源丰富,采集方便,不影响供者;其中的干祖细胞较成体骨髓的干祖细胞更 原始,增殖和自我更新能力强,无免疫原性等优势,对其进行开发和应用,将 对干 细胞组织工程及其应用具有深远意义。 研究证实多种生长因子对内皮祖细胞的生长有影响作用,由于脐带血非造血 干/祖细胞和骨髓非造血干/祖细胞具有相似的细胞表型和分化潜能,因此可以选用 有利于骨髓非造血祖细胞生长的生长因子来促进脐带血非造血祖细胞的生长。目前 用于内皮祖细胞诱导培养的常用细胞因子有血管内皮生长因子,表皮生长 因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子?。是 一种对血管内皮细胞具有高度特异性的肝素结合蛋白,具有促进动脉、静脉以及淋 巴管来源的内皮细胞生长的作用,血管内皮细胞是发挥作用的主要靶细胞钉。 通过表达的一受体激活蛋白激酶,发挥促进有丝分裂和抗 凋亡等作用‘。研究证实,能明显改善的细胞黏附、迁移和增殖能力。 等证明? 的短暂心肌缺血后可以使心肌细胞内的升高? 倍。研究发现急性心肌梗死患者外周血单个核细胞?和的数量 与血浆水平呈正相关。最近的研究表明,还能够促进人外周血的增 殖和分化,并在该过程中扮演着十分重要的角色?。正常心肌、血管组织中 含量极低,缺血、缺氧可刺激的表达,体外给予,特别是局部给予可能 是发挥其最大生物学效应必需和可行的途径。和已经被证实能够促进非造 血成体干/祖细胞细胞的生长?蛐’,二者对于细胞周期的影响均作用在早期 限制 点,刺激?,?等早期基因的表达,调节细胞从静息状态进入细胞周期一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 的比例。碱性成纤维细胞生长因子对维持间充质干细胞分化和增殖潜能具有 重要作用“?。 本实验通过密度梯度离心得到单个核细胞后,通过体外选择性诱导培养得到 ,探讨的体外培养、生长特性及鉴定方法。 .材料与方法 .脐带血采集 脐血采自北京协和医院产科病房。均经产妇及其家属知情同意,选取例足月 行剖腹产的健康产妇,待胎盘取出后,用 无菌采血袋采集胎盘端脐带血,采 血量为~,充分摇匀抗凝,于内分离单个核细胞。 .实验用主要仪器设备 仪器名称 生产厂家 型二氧化碳孵箱 德国公司 月坛牌洁净工作台 半导体设备一厂 一 荧光倒置显微镜 公司 公司 /电子分析天平 奥立龙型计 公司 美国 纯水仪 公司 . 流式细胞仪 生物倒置相差显微镜 公司 .试剂及来源 淋巴细胞分离液 天津灏洋生物公司 ’ 中国医学科学院基础学研究所细胞中心 中国医学科学院基础学研究所细胞中心 % .%胰蛋白酶. 中国医学科学院基础学研究所细胞中心 基础培养基, 公司 公司 , ,?, 公司 ?,? 抗体 公司 公司 抗,单抗 公司 抗单抗 公司 一二抗 .细胞分离及培养 采用 液以:将脐带血稀释混合,取人淋巴细胞分离液加入一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 离心管中,吸取稀释后的脐带血轻加于淋巴细胞分离液上,/离心 ,吸取中间白膜层细胞移到离心管中,再按:的比例加入洗细胞, /,离心,弃上清,沉淀以重悬/,,重复上述洗涤 步骤一次。最后沉淀细胞以培养基%/血管内皮生长因子 /碱性成纤维细胞生长因子?,/表皮生长因子 ,/胰岛素样生长因子‘重悬后,接种至培养瓶中。?,%: 孵育。待培养至第天时,取上层未贴壁细胞移至新培养瓶继续培养,添加新鲜 培养基。之后每天换液次。 .流式细胞术检测细胞,,表达率 ?消化,收 取培养至第天的贴壁细胞,以.%胰蛋白酶.% 集细胞,洗次,直接荧光标记:分三管,各管中加入?,? 灿 重悬细胞,流式 以及空白对照,?避光孵育,洗次,最后“ 细胞仪检测。间接荧光标记:细胞定容至肚,各管中加入抗一抗斗,?孵 育,各管加入. 洗次,/,离心,止重悬,加入 一二抗此,?避光孵育,.洗次,肚重悬,上流式细胞仪 检测。 .免疫细胞化学鉴定 采用孔板培养细胞,?预冷,弃去培养基,?洗次,各, %多聚甲醛?固定,洗次,每次。各孔中分别加入一抗: ?,,,对照组中不加一抗。?过夜,后以?预热的洗 次,每次,加入一二抗,对照组中也加入等量的二抗,?避光孵育, 洗次,每次。%甘油封闭,置倒置荧光显微镜下观察。 .实验结果 . 两种培养方法获得内皮祖细胞数量的比较 从脐血获得的单个核细胞接种天后,分别选取贴壁细胞和悬浮细胞进行培养 至第天后,观察两种方法所获得细胞的形态及计算数量。发现当选取贴壁细 胞 进行培养,细胞总数较少,镜下,平均每个视野为如表,并且无梭 形样内皮祖细胞出现如图;而选取悬浮细胞进行培养,至第天时,细胞数 量为.,并且出现梭形样内皮祖细胞如图。 表两种培养方法获得细胞数量的比较 .?圬, 一? 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 . :图两种不同方法所获比较 艉 . 撕 :.; .细胞形态学观察 悬浮细胞培养至第天,光镜观察,出现细胞集落如图。培养至第天 后,贴壁细胞按形态可分为三类:梭形内皮样细胞;体积较大且胞内颗粒较多; 圆 形且体积较小的细胞,细胞总数较少如图。培养至天时,细胞数量总体明 显增多,梭形样细胞的绝对数量也增多如图。培养至天,细胞无凋亡迹象 如图。细胞培养至天时,数目明显减少,并且开始凋亡,梭形样细胞几乎 减少至零如图。 ‰ 一 争 铷 一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 图脐带血单个核细胞所获得的内皮祖细胞 仔. :;印 ; 白,;啪跚 ; . .细胞生长曲线测定 人脐血源性内皮祖细胞原代培养生长曲线显示,细胞在接种后前天为潜伏 期, 细胞逐渐开始贴壁,无明显扩增;天以后,细胞进入对数生长期,此时细胞增 殖 活跃;培养至第天时,细胞数目最多;到天后,进入衰退期,细胞开始凋亡, 数目减少,如表。 表细胞生长情况, ’ . 一? 以及 图脐带血内皮祖细胞免疫荧光染色 舶 : ; . 如时 汕 : 锄’?舐锄吼 :?, 甜. .流式细胞术检测内皮祖细胞含量一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 对培养至第天的内皮祖细胞进行,阳性百分率分析图,门 内皮样形态细胞中,二者与对照组相比阳性率均升高,其中阳性率为 .%?.%.,阳性率为.%?.%.,阳性率为 .%。 饿吐?咖 ?邯 ,锄 嚣 . ? ? . ?一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 图流式细胞术分析内皮祖细胞,和表达率 ,. .”. .讨论 脐带血中含有多种干祖细胞,这些细胞在体外适宜的培养条件下可以扩增, 并 且经诱导能够分化为内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细 胞等多 种组织细胞“’?。研究已经证实,脐带血中的细胞密度是外周血的倍以上, 而且这些细胞在体外培养后能够产生较多的。 研究证实,有多种生长因子对内皮祖细胞的体外生长有调控作用们,目前常 用的细胞因子有血管内皮生长因子,表皮生长因子、碱性成纤维细胞 生长因子、胰岛素样生长因子?。本实验亦采用这四种因子进行体外 培养。 目前已有的研究报道多沿用类似分离骨髓的贴壁传代分离培养的方法,借 助换液去除不贴壁细胞,传代纯化培养出。但有研究心比较了经抗体富 集后的脐带血单个核细胞培养的贴壁细胞和天后取非贴壁细胞培养后的细 胞形态 不尽相同,天后采取非贴壁细胞培养的具有特征的细胞量明显高于贴壁细胞 培养出的。故本研究对上清液非贴壁细胞进行了诱导培养。文献还证实乜,硎 在体外培养过程中会出现不同形态的细胞,是的不同亚型的表现。已有文 献进一步证实确是一群异质性很强的细胞群,且在各实验室特定培养条件下。 从本文的结果来看,其生长情况不同,真正具有形成血管能力的细胞可能是其中的 一个亚群。 新近研究还证实汹,脐带血单个核细胞经培养后可见有两种主要类型的内皮祖 细胞,即早内皮祖细胞和晚内皮祖细胞,其中『者细胞表型为: ;后者为一。本文结果中,脐带血单个核细 胞经本体系培养后的细胞表型为,但其阳性率很低,提 示经本体系培养后得到的细胞可能为晚内皮祖细胞。是否为晚内皮祖细胞还需 进一步体内外成血管等实验的验证。 本实验室建立的培养体系显示可以从脐带血分离的单个核细胞,接种后第天 的悬浮细胞培养后而获得较多量的,为体外培养提供了又一新的研究途径。 但是,此种促进血管新生的详细机理还需进一步实验研究验证。 .结论 利用本实验室建立的培养体系即从脐血分离的单个核细胞以 %‖血管内皮生长因子,/碱性成纤维细胞生长因一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 子?,/表皮生长因子,/胰岛素样生长因子培养,至第 天时,取上层未贴壁细胞移至新培养瓶继续培养,经过免疫细胞化学和流式细胞术 对其进行内皮祖细胞相关表型进行鉴定后,结论是利用本实验室建立的培养体系成 功培养出内皮祖细胞。 .下一步需进行的研究 由于内皮祖细胞是一群异质性很强细胞群,不同文献所用的分离方法及培养方 法有所不同,故培养出的内皮祖细胞在体内外成血管作用亦有差别,本研究下一步 需要进行的工作是:、利用本研究培养出的进行体外成血管实验,观察其成 血管能力。、将经过鉴定的输注肢缺血的免疫缺陷小鼠模型体内,观察其血 管新生方面的作用。、分离并培养转基因小鼠骨髓来源内皮祖细胞,输入后 肢缺血的免疫缺陷小鼠体内,追踪内皮祖细胞如何迁移至缺血部位以及的具 体作用直接参与还是通过分泌生长因子等物质间接促进血管新 生。 .参考文献. .觚 .,:;. .’ , ,.,:;. ,.,;,.,,.,,.,. . 矽 /嬲 曰, .. 撇,.,,.,做,.,,.,,.,,., .,... 锄,.,,.,锄 . . .?. ,.. 锄,,锄,.,钆.,,.,锄 锣 . ?. ,., ? ,..,,.,,..,,..,,.,,., 甜 以 , ., ., , .., , .., 锄, 册 、? 萄 撕. . . . ,.,,., ’..一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 沁. . ,? 籼,.,,.,,,,.,,.,, ,.. ..,唱,., 保; .: . ,?. ,.,,.,,.,,.,“,.,锄苫,.,,.., ,..,. .娼,.,,..,,.,,.,锄 ,...仔 , .. ,, 虢 . 舶: ,, .盯 : , 锄锄, 一. , ., , ....:.. 李秀森,郭子宽,杨靖清,等.骨髓间充质干细胞的生物学特征.解放军 医学杂志,,:.. , .? 、?. ,,:. , , , 二 . 、 , ?. 巧 【】.. : ,、 ,. 。. 伊、?,,:?. 】. . . ~ , ?傅 ,【】 ,,:?. , .啪 , ,:..觚 、 .., ,:?.. , ., 、?哪 .’ ?掣、? 中国医学科学院&北京协和医学院硕学位论文: ? ., , ., , , . , . , . , , ,,: 、机 . 丘一. , 妇睹 , , ..啪 ,, :破【】. 锄,,:. . 锄,.锄,.如, 】.砌.,,:. 陈飞兰,张华容,徐承平等../轴活化诱导人内皮祖细胞增殖、迁 移及管型形成.基础医学与临床,,:.. , 甜口,. 黜, 啪 . 舵 : 沁,,:?., , ,订讲. 旧, 琢;.,.:?. 丘,‰妇,锄 ,酣讲. 协培啪 ., :.. . ,、 , , 硒 .. . . ...,:一? 对 脐血来源蛋白表达的作用一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 前言 作为细胞的重要信使物质,参与细胞多种生理功能的调控,是细胞生长, 增殖,分化,凋亡的重要调控因子?。而是钙离子载体的代表,能与钙离子 形成稳定的复合物,充当流动的载体,它可使细胞膜上的钙离子通路开放,导 致细胞内钙离子浓度增高。作用于不同细胞,所产生的效应不同,涉及到的 信号转到通路亦有所不同。如增高了的作为第二信使可促使蛋白激酶 和其他钙依赖性蛋白激酶活化,并催化细胞内多种蛋白质磷酸化,从而启动 细胞活 化、增殖瞳’。有文献报道,通过氧化酶途径或者线粒体通透性转变 从而增加产生继而导致多种细胞凋亡阳川。在诱导一细胞凋亡实验中, 通过快速提高细胞内钙离子浓度,打乱了细胞内钙离子稳态平衡,钙离子平 衡的紊乱导致从 /?与乙酰胆碱酯酶基因启动子从 模块的解离,进而激活了乙酰胆碱酯酶的活性,启动细胞凋亡。办可以通过 其他信号通路影响细胞功能。也可以通过激活经典途径,?? 途径促进细胞神经突及晶状体上皮细胞等的生长盯圳。 有研究表明?使用钙离子载体刺激外周血单个核细胞或其他各种 干/祖细胞细胞造血干细胞、急慢性白血病细胞等,在短时间内生成树突状 细胞。但是对于脐带血来源的内皮祖细胞或内皮细胞的影响至今尚未 见报道,故本研究选择进行了有关实验研究。 蛋白质是生命的物质基础,是人体生命活动的体现者,其表达可受多环节多 因 。。因此,有 素调控,疾病时细胞蛋白质的组成及变化与正常状态下有很大差异 效地鉴别细胞表达的蛋白质变化将为疾病的诊断、监测和药物治疗作用机制 提供依 据 ’惦。 蛋白质芯片技术,即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱/? ? ,??是近几年迅速发展起来的用于蛋白质组学研究的 一种新技术,该技术的基本原理是由年诺贝尔化学奖获得者田中耕一于年 提出的,基于这一技术,美国的赛弗吉公司开发出了蛋白质芯片 系统。该技术利用经过化学性阴离子,阳离子,疏水或亲水性 或者生物性抗体,受体等修饰的芯片,使其能够选择性地结合被检标本中的 某 些蛋白质,被结合的蛋白质添加能量吸收分子后,通过激光的作用,解离成正电离 子,当其通过电场时,检测其在电场中的飞行时问,检测到的信号由高速模拟数字 转换器转换并记录。最后,被检测蛋白质以一系列峰值的形式呈现,这些特异性波 峰构成了指纹图谱卜。蛋白质分析仪主要由以下三部分组成:蛋白质芯片, 质谱分析仪和数据处理软件,其中蛋白质芯片部分是工技术的核心,这也是与 其他质谱分析技术的本质区别。芯片一般是一块儿咖姗的铝板,其上有个或一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 个舢的点样点组成,点样点经过化学的阴离子,弱阳离子,疏水,亲水的, 固相金属的或生物的处理抗原一抗体,配体一受体,酶一底物等后可以选择性 吸附特异性蛋白。质谱分析仪由一个电脉冲,和氦激光器组成,样品经激光照射 后呈离子化,离子化的样品在电场中被加速飞行至管中。由于质荷比的不同, 离子化后的不同蛋白质依次进入管中。经过质谱分析的数据以蛋白分子量/ 相对丰度输出。为了比较两个样本间蛋白量的差异,软件还可以将其转换为一维凝 胶电泳的形式。另外,结果经软件处理后还可以进行样本问蛋白表达量的统 计学分 析‘引。 目前,蛋白质芯片技术已经应用在于医学研究领域中,如各种恶性肿瘤 的标志物的检测,在过去的几十年问,无论在科研还是临床上都花费了较大的人力, 物力和财力来提高癌症的治疗水平,但是收效甚微,其中原因之一就是在于癌症早 期确诊能力有待提高,蛋白质组学的发展为医生和研究者在肿瘤的早期诊断提供了 新的研究途径。 由于??是通过蛋白质谱或蛋白质差示分析,对一些表达上调或下调 蛋白进行筛选、鉴定和定量分析的,从中发现某些能作为某种代谢性疾病异常代谢 物、药物反应产物、肿瘤以及病原微生物感染的生物学标志心舻引。另外,该技术在 识别特定蛋白质的表达物、进行蛋白质水平的药物筛选、揭示蛋白质激酶的作用、 蛋白质翻译后修饰、蛋白质问的相互作用、测定血清中的小分子物质含量等方面均 取得应用效果心‘。 与研究蛋白质组学的经典技术如二维凝胶电泳和生物质谱相比,集芯 片技术和质谱技术于一身,整合样品的分离、纯化、生化反应和检测分析为 一体, 具有分析速度快、样品用量少、特异性强、分辨率高、可检测的分子量范围广、检 测样品无需复杂处理、选择性好和高通量等特点。有以下几点优势:待测样本 来源广且样品无需复杂处理,如血清、尿液、唾液、脑脊液、细胞培养液、组织提 取物等,不需要特殊处理,可以直接点样进行检测分析粥吨;样品用量极少, 每次分析只需要.~儿或个细胞的超微量样本,且范围广.~儿 。;可检测的分子量范围很广,可分析以下的蛋白质 ,传统二维凝 胶电泳只能分析大于的蛋白,丢失了一些有意义的小分子量蛋白如血管紧张 素. ,神经降压肽.,胰岛素. ,而能够很好 的分析小分子量蛋白。亦可以分析左右的大分子量蛋白 。可 进行小型实验或高通量检测自由选择,每次可测、、或个样品,可满足 临床检测、普查或大样本筛查的需要;高通量分析,检测速度快,传统的? 进行蛋白质组学研究,从蛋白分离,染色及图像处理耗时较长,并且不能进行高通 量分析。可进行高通量分析,一次性可检测个样品。?;分析软件可 以迅速发现各种疾病特异性变化的差异蛋白质,用于发现与疾病相关的一种或一组中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 一一 生物标记物,提供疾病诊断的最佳组合指标;而二维电泳胶上的蛋白质斑点往往包 含一种以上的蛋白质分子。该技术的的出现为蛋白质差异分析提供了新的有 力工 具。 .材料与方法 .样品细胞来源:选用本实验室已有稳定培养体系的内皮祖细胞和本实 验室培养的正常脐带静脉内皮细胞,所用内皮祖细胞为人脐带血来源取自北 京协 和医院足月健康分娩的新生儿,产妇知情同意,经免疫组化鉴定,符合实验性 研 究。 .主要试剂和仪器:人淋巴细胞分离液?天津灏洋生物公司, 培养基,公司,胎牛血清,公司,内皮细胞 生长因子公司,碱性成纤维生长因子公司, 表皮生长因子公司,胰岛素样生长因子,、?’、 谷氨酰胺及双抗中国医学科学院基础医学研究所细胞中心,碧云天生物 技术研究所,蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所,一, ,弱阳离子芯片 ,倒置相差显微镜 公司,高速离心机公司,细胞超声破碎仪 公司, ???公司。 . 作用于体外培养的 选择培养至第天的细胞进行干预。 哺等以心肌 细胞为研究对象,分别给予心肌细胞,州的,结果显示州对于心 肌细胞无细胞毒性,但是明显促进了的表达,而 的对于心肌细胞具 有明显的毒性,但是与相比,表达量明显降低。通过预实验也发现当 浓度达到州时,细胞凋亡严重,所以最终确定的作用浓度为,,,州, 作用时间小时。本文用量参照上述文献进行,作用时间为小时。 不同浓度的配制:溶解粉末状将其配制为浓度为姗/的储备液,临 用时培养基稀释为相应浓度。实验分组情况如下:对照组, 组, 洲组, 州组。 . 作用下细胞内游离钙离子浓度的测定 采用一为钙离子指示剂进行钙离子相对浓度检测。一 是一种可以 穿透细胞膜的荧光染料。一 的荧光非常弱,其荧光不会随钙离子浓度升高 而增强。一 进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成一,从而被滞留 在细胞内。一可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激 发波长为,最大发射波长为 。一,储存液的配制:取 一, , 溶解,即为浓度是岬/的储存液,分装并且一?保存备用,.细胞蛋白样本的 制备参考有关研究口?们配置细胞裂解液:裂解液成分为: 一 ., , %,胃蛋白酉每抑带剂./, 亮抑制肽 ./,抑蛋白酶肽 /, , ?,苯甲 ?一甘油弼?酸钠/, 基磺酰氟./。取出药物干预后的细胞,预冷洗遍,吸出废液。加入. 左右,用细胞刮刀轻轻地刮取细胞,收集细胞悬液至管中,转离心分钟, 小心吸出上清,加入细胞裂解液肚,反复吹吸,并于?作用。, ?离心。吸出上清保存于一?备用。 .蛋白浓度测定: ..曲线制备 取.蛋白标准配制液加入到的标准品中,充分溶解后即配制成 /的蛋白标准液,分装此/管,一?保存。 取此标准品溶液,加稀释液,即配成“/的标准液,梯度稀释表 。一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 标准品 乩稀释液 乩 ..蛋白浓度测定 采用 法进行蛋白浓度测定,在碱性环境下蛋白质 与络合并将还原成。与结合形成稳定的紫蓝色复合物,在 处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度,具体步 骤如下: 将待测样品分别稀释,,倍;加标准品溶液和待测样品溶液各此;各孔 加入工作液止按:加入试剂和试剂,?放置分钟。酶标仪 波长检测。 .蛋白活化、点样: 获得的蛋白通过生物芯片处理器点样使蛋白与芯片结合,结合能量吸收 分子 ,蛋白活化后,芯片上保留的蛋白形成晶 体,在特异的激光照射后,晶体发生解离作用,由于其中加有一个正电荷,在 电场 中向阴极飞去,分子量大的飞行时间长,分子量小的飞行时间短,以此标记蛋 白质 的分子量,绘出蛋白质的图谱。 本实验中采用弱阳离子芯片,操作步骤: 将芯片装于处理器拖槽上, 每孔加入 ,.,振荡一次,共两次。用上述 四倍体积稀释蛋白提取液。 每孔加样品 ,?作用,倒出。 取 出芯片,风干,计算风干时间。每蛋白点加 饱和芥子酸溶于%乙 腈和.%三氟乙酸,风干。 上机读取芯片数据。 .芯片检测及数据处理: 型蛋白芯片生物系统读取芯片 采用 信息。用加有标准蛋白质的卜?芯片校正仪器。使用蛋白芯片. 一 软件采集信噪比大于、质荷比/为 的蛋白峰,芯片阅读仪参数 ? 设置如下:激光强度,检测灵敏度,优化范围 ,最高相对分子质 量 ,芯片上的每个点采集次。由于受金属离子及基质影响,本研究对相 对分子质量在 以下的蛋白峰予以排除。蛋白峰强度相差.倍以上者定义为 差异蛋白。 .数据分析: 采用 软件自动采集数据, .软件 统计分析对照组与实验组问的差异表达蛋白质,组间蛋白峰比较采用检验, 确定一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 .时差异具有统计学意义。 . 实验结果 .不同浓度干预下细胞内钙离子浓度变化 作为钙离子载体运载细胞外钙离子进入细胞内,从而提高细胞内钙离子 水平,流式细胞术检测结果显示,当浓度为州时,细胞阳性率为.%; 当浓度为洲时,细胞凋亡明显图,钙离子浓度亦下降,为.%。 试暖 : . 中国医学科学院&北京协和医学院 伽嗵 图不同浓度作用下,细胞内钙离子相对浓度的流式结果图 .分别为,,洲时的散点图,当浓度达到叫时,细胞凋亡明显增加; . 分别为,,洲时细胞阳性率 .不同浓度干预下细胞阳性率的变化 是内皮祖细胞和内皮细胞共同的标记物之一,本实验中检测阳性 率来观察对于内皮祖细胞分化的影响。不同浓度,,州作用 后,流式细胞术检测细胞阳性率。结果显示图,当浓度为叫 时,与对照组.%相比,细胞阳性率有所降低,是.%.; 浓度为洲时,阳性率是.%.;浓度为洲时,阳性率是.%.; ? 洲 叫一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 刚叫 叫 图.不同浓度干预下,细胞阳性率 . 不同浓度作用下细胞散点图; .不同浓度作用下细 胞阳性率 . 检测不同浓度干预下蛋白表达的变化 ..四组均检测出较多的蛋白质峰 软件对所有蛋白质进行标准化 各组样本蛋白质芯片检测用 后,以减少不同芯片、仪器状态波动等因素引起的实验误差。每例样本在质 荷比 .?均能检测出个蛋白峰。 ..各组间蛋白差异表达明显的峰 与对照组相比,,, 作用的检测结果,发现共有个蛋白 差异表达明显的峰。其中,高表达的有个,低表达的有个表,.。 表 蛋白芯片筛选到干预组与对照组的差异蛋白. 表达量降低的蛋白 质荷比/ 表达量增高的蛋白 质荷比/ 上? 上 ? 上 十 ? ” 上千一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文?? 争 , ?拿 皿 佰 ? 一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 咖 嗍 锄 。,广、.哦炒怕 埔 飞胁“ .赢二.。炉二硝 一 . . .一, 一 几弘忡.。二妒吣岫帕八, ?婶岫队.‖ 一 一 ‘ ? 一. . :州帆‰ ~削帆一,、‰一 ?.’ :; 一 一 ‘ . 儿一 . ‘ . 肌,~入..一一 ‰. ~。‖一. ?一 ? 崎唑堕 一’ 四 弋 弋 \ \ 一? 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 一? 一 ‘?飞~?嘲?~ 一二 。?.。.“?、嘲., 一 一~一,尸\?一。..; 一??一 .?.一 ~ ?一一一 认凸.,掣..?,?、~?/、~?~ :二 ?~??吩一’、、 。 。一?一 :。???。? ; 一一、~., 一一/“‘“\~.、 .人一 一一/\ 一一 . ” 、.,./ .,.、?八、一一.. ? 绷 ?? 。 。一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 舢 凸 一 一一舢一肌一/、一 融~飞~。 . .小 酣~小小‰帆 心.一帅~.?。。一峨,.二八臀。 ‖爻人~厶 ’。 ,、‘烈二水?、,一 胍武儿 绷?? , \ ~?\ 一’ 一? 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 咖印?嗍 ??‘ 一一一 .一?‘ 一?一 一一 ‘? 一厂\ 、一??‘..?. ?‘吨.??一?一?.??、。。。??/ 一 一一一 一~ ; 。 一 : , “ 必抽凼呼~?小~/ .. , . 。/。\?、?? ? 。。一八一.八一 一 沿. 一 州 。. 、 .从一小~习一 黼 鳓嬲?嘲 豁爝 、、、 ?..、\ .. ? 一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 ?? 翟? 甄? 一? 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 酗日 ,奄 ?? ‰ “.~一 仃 ? ?/\:剁意 .衙 . 仃 ?、“.八.. ,‘ ..... 也凸. ? ” , ’’ ”~划耐州~ ;订 . 人....“.小 帆厂\? 峨一?儿’ 叮?一 』’州”? . 绷 溯 艄 ’ ’’’~ ?\一一 中国医学科学院&北京协和医学院硕士学位论文 . 湖 \ 从?? 。\/八瓜 . \小心 认.八瓦”一”一: 一 ,’、 . ’ , ? 、 .八氏舻怕乱眇 。,小 、. 【 一 ~ 。:一儿 阢小/垤她一 一 勰翟:鞫霸盘霉啪 囊 馏缀霭霸国盘霭霭翰 罚 、\ 。。