盆腔脏器脱垂患者主韧带和阴道前壁中神经肽Y及其受体的表达及意义（可编辑）

盆腔脏器脱垂患者主韧带和阴道前壁中神经肽Y及其受体的达及意义（可编辑） 盆腔脏器脱垂患者主韧带和阴道前壁中神经肽Y及其受 体的表达及意义 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 为,J，，(10 论文作者签名: 论文作者签名:二噬日期:垒直趔望日期: 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在 攻读学位期I"(-1论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名:猛丝 指导教师签名: 窿臣翌笙 日 期:卫21:三:f! 目 录 一、摘要 中文论著摘 要………………………………………………………………(1 英文论著摘 要…………………………………………………………………5 二、英文缩略 语…………………………………………………………………((10 三、论文 ―U(―(1一 日? 吾……………………………………………………………………………………………………11 材料与方 法……………………………………………………………………(11 实验结 果………………………………………………………………………17 讨 论……………………………………………………………………………………………………25 结 论………………………………………………………………………………………………………28 四、本研究创新性的自我评 价……………………………………………………((29 五、参考文 献………………………………………………………………………30 六、附录 综 述………………………………………………………………………………………………………31 在学期间科研成 绩……………………………………………………………((40 致 谢………………………………………………………………………………………………………41 个人简 介………………………………………………………………………((42 ??中文论著摘要?? 盆腔脏器脱垂患者主韧带和阴道前壁中 神经肽Y及其受体的表达及意义 刖 吾 Floor 随着人口的老龄化，盆底功能障碍性疾病 Pelvic Dysfunction，PFD 已经被越来越多的人重视，它已经成为众所周知的老年性疾病的 一种，主要包括 盆腔脏器脱垂 pelvicorgan urinary prolapse，POP 和压力性尿失禁 stress PFD的研究主要集中在影像学、胶原代谢、生物力学、雌激素及 其受体等方面， 而对神经肌肉生理学研究甚少。正常阴道壁有丰富的神经纤维分 布，根据盆底神 经损伤机制，推测盆底组织神经递质的改变也可能参与PFD的发病。早在八十年 代，就有研究发现阴道壁内有肽能神经纤维，也有研究发现，人类生殖系统存在 intestinal 血管活性肠肽 vasoactive peptide，VIP 、神经肽Y neuropeptideY，NPY 、 P物质 substanceP，SP 、降钙素基因相关肽 calcitonin generelatedpeptide，CGRP 、 intestinal 生长抑素 somatostatin 等神经肽，以血管活性肠肽 vasoactivepeptide， VIP 和神经肽Y neuropeptide 学院的Tatemoto首先从猪脑组织中纯化出的多肽，它属于胰多肽家族比1，本实 验通过检测盆底主韧带及阴道前壁组织中神经肽Y及其受体的表达情况，探讨神 经肽Y及其受体表达与POP发生发展的相关性。 材料与方法 一、材料 32例子宫脱垂患者的主韧带、膨出阴道前壁组织全层及17例非脱垂患者 宫 医科大学附属盛京医院妇科手术切除的组织。标本采集均经医院伦理委员会批准 及获得患者本人或家属的知情同意，并签署知情同意书。诊断标准依据1996年国 际尿控协会公布的POP(Q分度标准，子宫脱垂I度和II度共16例，为A组;I? 度和?度共16例，为B组。所有组织平均分成两份，一份经福尔马林固定，常规 石蜡包埋，另一份放入 1(5ml ， Eppendorf管中液氮保存。 二、方法: 一 免疫组织化学染色 按链霉素抗生物素蛋白(过氧化物酶 S(P 法行免疫组织化学染色。切片常 规脱蜡，胃蛋白酶进行抗原修复，一抗4。C孵育过夜，DAB显 色，苏木素复染。 用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:光镜下在每张切片中随机选取5个高 倍视野，细胞间质棕黄色染色为阳性染色。 -- RT-PCR 1、RNA的提取 TRIz01 。 从液氮中取出标本，TRIzol法提取总RNA 按100mg组织加lml 2、RT反应 取已提取的RNA 1(259l加入反转录反应液里进行反转录 合成cDNA 反应体 系为1091 。 3、PCR扩增 ACC ACA CTG TCT CCCAC(3’，下游引 物 NPY-Y1引物:上游引物5'-CCA 5'-CCAGCAGGCTCCAAA AGACAGGAG G(3’;NPYoY2引物:上游引物5'-AGG CGAGTA(3’，下游引物5'-AAGGTAAAG CGAGTTCAG(3’;内参 照物采用p(肌 CGC CAC GGG CCCAGGCA(3’，下游引物 动蛋白 p(acfin ，上游引物5'-GTG 5'-CTCCTT儿虹GTCACGCACGAT TTC(3’。PCR反应体系扩增程序按以下条 件设定:940C40s，退火40s，72。C 后72?延伸7min。 4、电泳 PCR产物各5“l经2,琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照，进行图象 2 分析。 三、统计学分析 B组及对照组三组之间NPY-Y1及Y2mRNA的比较用单项方差分析，P 0(05为有 统计学意义。脱垂组NPY-Y1及Y2mRNA在主韧带及阴道前壁表达的相关性分别 采用pearson相关分析。 实验结果 一、NPY在主韧带及阴道前壁组织中的表达情况 各组患者主韧带主要由平滑肌细胞、纤维细胞和胶原成分构成，含有相当数 量的血管、神经等。镜下可见阴道壁由表及里分别由粘膜层、肌 层和外膜构成。 粘膜由上皮和固有层组成，上皮为角化不明显的复层扁平细胞;固有层主要为结 缔组织，其中可见平滑肌组织、小血管、毛细血管和小神经组织等结构。NPY在 各组患者大部分主韧带及阴道前壁上均有分布，显微镜下观察，NPY主要在平滑 肌细胞、胶原成分、纤维细胞中表达，并与血管关系密切。在脱垂组主韧带及阴 道前壁组织中的阳性表达率分别为25(O,、34(4,，低于对照组分别为76(5,、70(6, 性 产O(024、0(035 。 二、NPY-Y1、Y2 mRNA在主韧带及阴道前壁组织中的表达情 况 通过RT(PCR发现，NPY(Y1及Y2mRNA在主韧带及阴道前壁组织中均有表 达。 在主韧带中，脱垂组NPY(Y1mRNA表达水平较对照组有升高趋势，差异有统 计学意义 P -0(003 。A、B两组之间比较NPY(Y1mRNA表达情况，差异无统计 学意义 尸(0(342 ，A组与对照组之间以及B组与对照组之间差异均有统计学意 mRNA表达水平较对照组有升高趋势，但 义 p O(016，P 0(001 。脱垂组NPY(Y2 差异无统计学意义 P--0(170 。A、B两组之间、A组与对照组 之间以及B组与对 照组之间比较NPY―Y2 3 P 0(065 。 在阴道前壁中，脱垂组NPY(Y1mRNA表达水平较对照组有升高趋势，差异有 统计学意义 尸:0(012 。A、B两组之间比较NPY(Y1mRNA表达情况，差异无统 ( 计学意义 卢O(861 ，A组与对照组之间以及B组与对照组之间差异均有统计学 意义 P--0(013，P -0(008 。脱垂组NPY(Y2mRNA表达水平较对照组有升高趋势， 差异有统计学意义 P O(002 。 三、NPY(Y1及NPY:-Y2mRNA表达的相关性 对脱垂组中NPY-Y1及Y2 mRNA进行pearson相关分析，结果显示:在主韧带 组织中，r---0(415，P 0(018，提示NPY-Y1及Y2mRNA在脱垂组表达呈正相关，且 mRNA 相关度较大。在阴道前壁组织中，r (0。216，P 0(235，提示NPY-Y1及Y2 在脱垂组表达无相关性。 结 论 l、子宫脱垂患者主韧带及阴道前壁组织中的NPY参与了POP的发生、发展。 2、子宫脱垂患者主韧带中NPY-Y1可能促进了子宫脱垂的发生。 3、子宫脱垂患者阴道前壁组织中NPY-Y1及Y2可能共同促进了子宫脱垂的发 生。 4、子宫脱垂患者主韧带中NPY-Y1及Y2可能在子宫脱垂发生发展中有协同作 用。 关键词 神经肽Y;翁底功能障碍性疾病;盆腔脏器脱垂;子宫脱垂 4 ??英文论著摘要?? and of Yand Expressions SignificanceNeuropeptide its inCardinal andAnterior Receptors Ligament WallTissueof Pelvic Vaginal OrganProlapse Abstract Asthe andmore attentionto populationaging，more floor peoplepay pelvic disease(Ithasbeenknownasa diseaseof dysfunction older,mainly includingpelvic and stress organ incontinence(POPandSUIoften it prolapse urinary CO(exist(andhas various and recent etiology ofthePFDfocusedon pathogenesis(Inyears，the study andits the imaging，collagen metabolism，bio-mechanics， estrogenreceptor,etc(，while liRlenerve―muscle normal wall isrichinnerve physiology(The vaginal fibers， tothe mechanismof floornerve according the in pelvic injury,suggestingchanges neurotransmittersalsobeinvolvedin pelvicorgan the ofPFD(As may pathogenesis asinthe foundthattherewere early eighties，the nervefiberswithin study peptidergic the inhuman vaginalwall，and alsofoundtheexistenceof reproductive system vasoactiveintestinal substance peptide，neuropeptideY P’ calcitonin generelated intestinaland peptide，somatostatin,etc(Vasoactive Yismost peptideneuropeptide abundantinall 1 Wasa to neuropeptide(In982，NPY polypeptidebelongspancreatic whichWasfirst from braintissueTatemotoin polypeptidefamily purified porcine by theSwedish Karolinska Institute，which(Inorderto the between explorerelationship the of Yandits andtheoccurrenceand expressionneuropeptide receptor development of use themethodof the POP,we main and tissue( detecting pelvicligamentsvaginal Materialsand methods 1、Tissue and samplesgroups POPandseventeen NON(POPcardinal Thirty―two and anterior ligamentparies tissue wereobtained from vaginasespecimens underwentresectionat patients surgical ofChinaMedical between ShengjingHospital 2008 and2009 University January 5 collectionwere theEthicsCommitteeandobtained October(Specimen approvedby informed the themselvesortheir informed consent families， andsigned by patients consent(Wethe criteriaofthe standards the used diagnostic POP-Q publishedby InternationalContinencein1996(Atotalof16caseswim IandIIof Society degree POPforA totalof16cases、析m IIIandIVofPOPforB the group;a degree group(All weredividedintotwo Wasfixedformalinandembeddedin samples parts(One by theotheronewasinto tubeand in paraffin，and put Eppendorfpreservedliqudnitrogen( 2、Methods Immunohistochemistry ImmunohistochemicalWas the staining by performed method(Thesectionswere to deparaffinized，waterprocessed， treatedbypepsinexpose andincubatedwith at4(0"C colorwas antigen primaryantibody overnight(The diaminobenzidineandthesectionswerecounterstained、析tll developed、析tll hematoxylin( Forthe antibodieswere PBS( control，the nonspecificreagent primary replacedby 5 Resultsassessment:Useimmunohistochemicalmethod:choose semiquantitative high has field wethiIlkthatitis ifit in buffy powerrandomly x400 andpositiveexpression intercellularsubstance( RT-PCR ofRNA: 1 Extraction RNA Takeoutofthe from extract themethod specimensliqudnitrogen，and using of lmlTRIzol1 TRIzol usingper00mgtissue ( reaction: 2 RT Put RNAwhichhasbeenextractedintoreverse reaction 1(25Itl transcriptionliquid undertakereverse to transcription( 3 PCRamplification NPY-Y1 5'-CCACTGACCTCTACACCC AC一3’， primers:upstreamprimer 5'-CCAGCAGGC downstream TCCAAAG??3’:NPY-Y2 primers:upstream primer CAGGAGCGA 5'-AAGGTA 5’??AGGAGA GTA-3’，downstream primer primet theframe AAGCGAGTT ofreference CAG一3’;within 13-actin，theupstream using CGCCCC CAC CTT 5'-GTGGGG AGG 5'-CTC CA一3‘，downstream primer primer GAT ofPCR set AATGTCACGCAC TTC一3’(Procedure Was amplification according to of that:94* 240s，anneal40s，72"C40s，35 anneal cycles。The p一 temperature 6 andY2were were 55(5"C，52(5?，50(7?(Before actin,NPY-Y1 amplification，they receivedin94。Cfor extendedfor7minafter 3min，and amplification( 4 Electrophoresis ofPCRwasunderwentin Gel Electrophoresis( 51xlproduction separation2, Agarose the Thentakea underultraviolet analysepicture( picture lamp，and 3、Statistical analysis wasusedforall test Thestatistical SPSS13(0 chi―square package analyses(The used betweenNPY andclinical Was todeterminethecorrelation expression ofNPY-Y1 andY2rnRNA A，Band factors(The group pathological comparison among wereconsidered control Wasanalized ofvariance(ValuesofP 0(05 group byanalysis 1 mRNA in betweenNPYoYandY2 expression statisticallysignificant(Therelationship was test( cardinal and anterior tissueanalized by ligamentparies vaginase pearson Results anterior ofNPYinthecardinal and paries 1(Expression ligament tissue vaginase are constitutedsmooth In ofeach cardinal patients group，the ligamentsmainly by numberof muscle and aconsiderable cells，fibroblastscollageningredients，containing mucous bloodvesselsand wallisconstituted layer nerves(Vaginal by layer,muscular is of andadventitiafromoutsidetoinsideunder composed pose microscope(Mucosa is which andlamina the stratified epithelium propria,andepithelium pinacocyte ofconnective keratinizednot whilethelamina is obviously propriamainlycomposed and whichwecallseesmoothmuscle blood tissue，in tissues，small vessels，capillaries and smallnervetissuestructure(NPYinboththecardinal express ligamentparies anterior tissueinall underthe microscope，NPYmainly vaginase patients(Observed inthesmoothmuscle andfiber cells，with expressed cells，collagencomposition vessels(The rateofNPYincardinal toblood ligament relationship positiveexpression thanthe and anterior tissueofPOP is 25(O,， 34(4,，lower paries vaginase group and anterior control cardinal paries group76(5,，70(6,俨 0(001，0(020 (Inligament thePOP in isless tissueof ofNPY B vaginase group，theexpression groupprolapsed a than Was significant group difference statisticaloftwo according analysisgroups 芦0(024，0(035 ( 7 1 thecardinal and ofNPY-YandY2mRNAin 2(Expression ligament anterior tissue panes vaglnase In foundthat Y2 were inthecardinal NPY-Y1and mRNA RT-PCR,we expressed and anterior tissue( ligament paries vaginase Inthe NPY-Y1 mRNA levelinPOP has cardinal group ligaments，the expression the toincreasecontrasttothecontrol thedifferencewas tendency group，and differencebetweenAandBisn’t statisticallysignificant P O(003 (Thegroup differencebetweenAandcontrol statisticallysignificant P O(342 (Thegroup group as aswellbetweenBandcontrolare 1 6，P group groupstatisticallysignificant P O(0 O(00 NPY-Y2mRNA levelinPOP hasthe to 1 (The expression group tendency contrast not increase tothecontrol thedifferenceis group，but statisticallysignificant and wellas Aand differencesbetweenA between P O(1 B，aS 70 (The group group control betweenBandcontrolarenot statistically group group group significant P 0(492，P 0(240，P 0(065 ( Inthe anterior NPY-Y1mRNA levelinPOP vaginasetissue，the paries expression hasthe toincreasecontrasttothecontrol thedifferencewas group tendency group，and 1 differencebetweenAandBisn’t statisticallysignificant P 0(02 (The group differencebetweenAandcontrol statisticallysignificant P O(861 (nlegroup group aswellasbetweenBandcontrol are 1 3，P group groupstatisticallysignificant P O(0 NPY-Y2mRNA levelinPOP hasthe to 0(008 (The expression group tendency increasecontrasttothecontrol thedifferenceWasnot group，and statisticallysignificant A differencesbetweenAand wellasbetween and P 0(002 (The group B，as group control arenot difference group statistically B between andcontrolis group significant P 0(002 ( groupstatistically mRNA 3(The betweenNPVYl andNPVY2 relationship expression the andY2mRNAwim While betweenNPY-Y1 analizingrelationship pearson testinPOP showedthat:inthecardinal tissue，r 0(415，P group，results ligament that thePOP Was 0(01 NPY-Y1andY2mRNA in 8，prompted expression group relevant the anterior tissue related，谢tll higher positively degree(Inparies vaginase r:-0(21 thatNPY-Y1 in POP andY2mRNA the 6，P 0(235，prompted expression group hadnocorrelation( 8 Conclusions and bothcardinal ofNPYin paries ligament POP 1、In expression group，the of and withthe development havea tissue relationshipgenesis amerior may vaginaSe POP( totheoccu玎e眦e havecontributed 1 incardinal may POP ligament 2、In group，NPY-Y ofuterine prolapse( tissue in anterior andY2 mayjointly POP vaginase 3、In paries group，NPY-Y1 ofuterine theoccurrence prolapse( promot have effect 1 andY2incardinal synergistic may 4、InPOP ligament group，NPY-Y withuterine in main of patients and POP,theligament iIlthe development genesis ofuterine and betheoccurrence andY2 development inNPY-Y1 may prolapse prolapse( Words Key floor prolapse organprolapse;uterine dysfunction;pelvic Y;pelvic neuropeptide 9 ??英文缩略语?? 10 ??论文?? 盆腔脏器脱垂患者主韧带和阴道前壁中 神经肽Y及其受体的表达及意义 刖 声 floor 女性盆底功能障碍性疾病 pelvicdysfunction，PFD ，是各种病因导致的 盆底支持组织薄弱，进而盆腔脏器移位，连锁引发其它盆腔器官的位置和功能异 常的一类疾病，其主要包括盆腔器官脱垂 pelvicorganprolapse，POP 及压力性 尿失禁 stress urinary 提高，盆底功能障碍性疾病已经被越来越多的人重视。POP与SUI常并存，其病因 和发病机理多样。目前认为，分娩造成盆底肌肉组织部分去神经支配和阴部神经 障碍在POP及SUI患者尤为明显。神经障碍可导致局部肌肉萎缩变薄，张力降低。 盆底神经损伤所致盆底肌肉薄弱，引起盆底支持及压力传导障碍，参与了POP及 SUI的发生。正常阴道壁有丰富的神经纤维分布，根据盆底神经损伤机制，推测盆 底组织神经递质的改变也可能参与PFD的发病?3。研究发现，人类生殖系统存在 intestinal 多种神经肽，以血管活性肠肽 vasoactive peptide，VIP 和神经肽Y Y，NPY 最为丰富。本实验通过检测盆底主韧带及阴道前壁组织 neuropeptide 中神经肽Y及其受体的表达情况，探讨神经肽Y及其受体表达与POP发生发展的相 关性。 材料与方法 一、材料 子宫脱垂组织标本:49例组织标本均来自中国医科大学附属盛京医院妇产科 2008年1月至2009年10月诊断为子宫脱垂并行子宫全切术或全盆底悬吊术患者的 主韧带及膨出阴道前壁组织全层。标本采集均经医院伦理委员会批准及获得患者 本人或家属的知情同意，并签署知情同意书。诊断标准依据1996年国际尿控协会 为A组，III组和IV组为B组。另取非脱垂组17例 同期相应年龄因宫颈鳞癌Ib期行 广泛子宫切除术患者的主韧带及阴道前壁组织全层标本 做对照。术中切取患者 组织平均分成两份，一份经福尔马林固定，常规石蜡包埋，另一份放入1(5ml Eppendorf管中液氮保存。 实验组及对照组所有患者均已婚，有经阴道分娩史，无其他结缔组织疾病， 手术前3个月未用任何雌激素药物治疗，术后病理回报无任何雌激素相关性疾病 如子宫肌瘤，子宫内膜异位症，功能性卵巢肿瘤等 。脱垂组与对照组在年龄、 孕次、产次、体重指数等方面差异无统计学意义 胗O(05 ，具有可比性 表1 。 二、实验试剂和仪器 l、主要试剂 兔抗人神经肽Y抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，二氨基联苯胺 DAB 显色剂及S-P试剂盒、胃蛋白酶购自北京中杉生物技术有限公司。 RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司，DL(2000Marker购自大连宝生物生物工程公 司。 2、主要仪器 自动电泳凝胶成像系统分析仪:香港 低温高速冷冻离心机 5417R -德国 PCR仪:TAKARA 12 电泳仪 BG-Power600i -北京 洁净工作台:北京半导体设备一厂 三、方法 一 免疫组化方法 1、组织切片在室温常规脱蜡 1 二甲苯I10min。 10min。 2 二甲苯II 3 无水酒精5min。 4 95,、85,、75,酒精各5min。 5 蒸馏水冲洗5min。 2、3,过氧化氢浸泡室温10min。 3、PBS室温冲洗三次每次3min。 4、胃蛋白酶室温消化60分钟。 5、蒸馏水冲洗室温3min。 6、PBS冲洗室温3min。 7、加血清室温10min。 8、加一抗4。C冰箱过夜 兔抗人NPY抗体1:50稀释 。 9、PBS室温冲洗三次每次5min