基于乳清蛋白运载及乳化作用提升高姜黄素生物使用的研究.doc

基于乳清蛋白运载及乳化作用提升高姜黄素生物使用的研究.doc 基于乳清蛋白运载及乳化作用提升高姜黄素生物使用的研究 第 1 章 绪 论 1.1课题背景及研究目的和意义 姜黄素Curcumin，CCM)是从姜黄中提取出的一种黄色色素，属于酚类物质。许多研究显示，姜黄素具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制?型糖尿病并发症、抑制血栓和心肌梗塞、抗癌等生物活性[1-4]。目前，姜黄素虽只作为一种食用色素使用，但因其较高的生物活性，使其在食品与药品行业中具有极大的开发与应用潜力，因此对姜黄素产品的安全性就有了更高的要求。在国内外姜黄素的提取还主要是采用常规的有机溶剂提取法。常规提取法往往需要大量的有机溶剂，并且耗时长，耗能多，污染环境，因溶剂残留和纯度不高而降低了产品的安全性和质量。为了克服常规提取方法的上述缺点，“非传统提取技术”应运而生。非传统提取技术是为了满足降低能耗，提高产品安全性和质量而开发和设计的提取工艺。为了得到高质量的姜黄素和其它姜黄素类化合物，本研究采用脉冲超声、微波及高压脉冲电场三种非传统提取技术研究姜黄素类化合物的提取工艺，得出最佳的提取方法和技术。尽管姜黄素的药理作用非常明确，但由于其自身的因素，极大地限制了它在临床上的应用。首先姜黄素不溶于水，酸性条件下不溶，在中性及碱性条件下不稳定[5]，从而大大降低了其吸收率。为了提高姜黄素在水中的溶解度，从而提高姜黄素在人体肠道中的吸收率，研究中分别采用了 β-乳球蛋白β-Lactoglobulin，β-Lg)和乳清蛋白Whey protein，WP)为材料，通过制备β-乳球蛋白/姜黄素β-Lg/CCM)复合物和姜黄素/乳清蛋白CCM/WP)纳米乳化体系以提高姜黄素在水中的溶解度，从而促进姜黄素在人体肠道中的吸收，同时，通过体外模拟胃肠道环境和建立 Caco-2 细胞模型模拟肠道细胞，以考察β-Lg/CCM 复合物和 CCM/WP 纳米乳化体系在人体胃肠道中的消化吸收作用。 1.2国内外研究现状分析 本研究的主要目的是采用非传统技术获得低能耗，高效率的姜黄素提取工艺，并通过制备 β-乳球蛋白/姜黄素复合物和姜黄素/乳清蛋白纳米乳化体系两种载体提高姜黄素的生物利用率。为了充 分获得与本研究相关的理论和技术知识，本文首先对姜黄素提取、β-乳球蛋白运载小分子生物活性物质、牛乳清蛋白纳米乳化体系及提高姜黄素生物利用等方面的研究现状进行分析。姜黄素是从姜黄中提取出的一种黄色色素，属于酚类物质，其存在形式主要有三种如图 1-1 所示)。溶液中姜黄素以酮—烯醇互变异构体的形式存在，其中烯醇式结构更加稳定，是姜黄素存在的主要形式。许多研究显示姜黄素的烯醇式结构和酚羟基在抗氧化活性上起着重要作用[6-10]。姜黄素在酸性条件下不溶于水，能溶于碱性水溶液，在酸性条件下稳定，耐高温，在中性、碱性及光照条件下会分解[5]。在碱性条件下，姜黄素最终降解为以阿巍酸、香草醛和丙酮为主的降解物[11]。在光照下会降解成香草酸，香草醛和阿巍酸[12]。 . 第 2 章 实验材料与方法 2.1 实验材料与仪器设备 2.2 测定方法 姜黄素 HPLC 测定参考 Pei-Yin Zhan 等人的方法[130]。色谱柱:AgilentTC-C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm;流动相:乙睛-5%冰醋酸(50:50，v/v);流速:lmL/min;柱温:25?;检测波长:425 nm;进样量:10 μL。分别制备 1 mg/mL 的姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素乙醇储备液。取一定量上述制备的三种品储备液等体积混合后，制备成不同浓度梯度的待测液。各标品在待测液中的浓度为:1、2.5、5、10、50 和 100 μg/mL。以标准品溶液浓度X)为横坐标，峰面积Y)为纵坐标，进行线性回归。所得回归方程分别为:y=46011x-103161R2=0.998)、y=40603x-73217R2=0.9973)和 y=40970x-79758R2=0.9973)。经标准曲线计算后，可得出三种姜黄素类化合物的总量。按式2-1)计算姜黄素类化合物得率。在姜黄素提取研究中，以姜黄素类化合物得率为指标确定提取工艺参数。利用差示扫描量热仪DSC)测定样品热稳定性。首先将 β-Lg 和 β-Lg/CCM复合物干品溶于 pH 7.0 的 0.05 mol/L 磷酸盐缓冲溶液 中，同时，保证两样品中的蛋白质浓度相同。取 10 μL 样品于钳锅中，用压盖机压盖后，于 25,100?范围内进行 DSC 扫描，升温速度为 10?/min。 第 3 章 姜黄素提取技术的研究 .....31 3.1 引言 ....31 3.2 脉冲超声辅助提取姜黄素类化合物.......31 3.3 微波辅助提取姜黄素类化合物.........44 3.4 高压脉冲电场辅助提取姜黄素类化合物.....49 3.4.1 电场强度的影响........50 3.4.2 脉冲电流强度的影响......51 3.4.3 电脉冲次数对姜黄素类化合物得率的影响......52 3.5 脉冲超声和微波辅助提取法的对比评价.....53 3.6 本章小结 ........59 第 4 章 β-Lg/CCM 复合物的形成和结构征及性质研究.....60 4.1 引言 ....60 4.2 β-Lg/CCM 复合物的形成.......61 4.3 β-Lg/CCM 复合物的结构表征.....66 4.4 β-Lg/CCM 复合物的性质.......73 4.5 本章小结 ........80 第 5 章 姜黄素纳米乳化体系制备及其稳定性的研究......81 5.1 引言 ....81 5.2 姜黄素在不同类型油脂中的溶解度........82 5.3 姜黄素纳米乳化体系的制备.......83 5.4 姜黄素纳米乳化体系的稳定性研究.......94 5.5 本章小结 ......101 第 6 章 β-Lg/CCM 和 CCM/WP 提高姜黄素生物利用率的研究 6.1 引言 姜黄素Curcumin，CCM)具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制?型糖尿病并发症、抑制血栓和心肌梗塞、抗癌等生物活性[1-4]。尽管姜黄素具有许多突出生物学功能，但由于姜黄素不溶于水，在碱 性条件下不稳定的性质大大降低了姜黄素的口服吸收率[5]。通过改变剂型来提高姜黄素的药理作用性能是一种重要而又方便的手段。目前这方面的工作还处于起步阶段，剂型研究中多集中于脂质体、纳米微粒、纳米胶、纳米结晶悬浮液、磷脂复合物、树状聚合物、环糊精包合物和微胶束等，但研究内容多集中于剂型的制备方法上，对于运载体系在胃肠道中的消化过程及其对姜黄素在肠道中的吸收作用还需要进一步的研究。本文分别以 β-乳球蛋白和乳清蛋白纳米乳化液为载体制备 β-乳球蛋白/姜黄素β-Lg/CCM)复合物和姜黄素/乳清蛋白CCM/WP)纳米乳化液两种载体运载姜黄素，结果表明，这两种运载方式都极大地提高了姜黄素的溶解性和稳定性，但这两种载体在胃肠道中的消化性及其对姜黄素在肠道中的吸收作用仍需进一步考察。Caco-2 细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，常被用来研究药物吸收的潜力，药物吸收的机制以及药物、营养物质、植物性成分的肠道代谢。Caco-2 细胞的结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有相同的细胞极性、紧密连接和微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层。药物透过 Caco-2 细胞单层的体外过程与药物口服后在肠中的吸收和代谢有良好的相关性，因此 Caco-2 细胞成为研究药物吸收转运和代谢最经典的体外模型之一。 结 论 本论文考察了脉冲超声、微波和高压脉冲电场技术对姜黄素提取得率的影响;研究了 β-乳球蛋白/姜黄素β-Lg/CCM)复合物的形成，结构表征及性质;研究了姜黄素纳米乳化体系的最佳制备工艺及其稳定性和对姜黄素的保护作用;考察了 β-Lg/CCM 复合物和姜黄素/乳清蛋白 CCM/WP)纳米乳化体系对姜黄素生物利用率的影响。主要结论如下: 1)采用单因素和响应面优化实验得出，脉冲超声辅助提取最佳工艺为:超声振幅 60%，83%乙醇，料液比 1:200，脉冲时间 3/1 (s/s)、超声提取时间 10min。脉冲超声辅助提取的效果优于连续超声提取效果。微波辅助提取最佳工艺为:72%乙醇浓度，20%微波 功率，微波提取 7 min。通过对姜黄素的得率、提取效率及能耗等因素的对比得出，微波更适合作为姜黄素类化合物的辅助提取技术，而高压脉冲电场处理引起姜黄素类化合物得率的下降，不适合作为姜黄素类化合物的提取技术。 2)β-Lg 与姜黄素反应特性为，每分子 β-Lg 通过疏水作用力与 1 分子姜黄素结合，而且姜黄素的结合会对蛋白质的二级结构产生一定程度的影响;在pH 6.0 的条件下姜黄素结合在 β-Lg 表面疏水性区域，而在 pH 7.0 的条件下姜黄素结合在 β-Lg 内部 β-桶形区域。姜黄素与 β-Lg 内部 β-桶形区域的结合较表面疏水区域更加牢固。当姜黄素与 β-Lg 复合后，不仅提高了 β-Lg 的热稳定性，同时使姜黄素的溶解度提高了 1590 多倍，而且，复合物在不同的 pH 条件下具有比较好的稳定性。在抗氧化实验中，β-Lg/CCM 复合物的形成降低了姜黄素清除自由基的能力，但却提高了还原 Fe3+的能力。