脾阳虚证大鼠心、肝、脑组织MAPK活性变化及温补脾阳方药对其影响的实验研究

脾阳虚证大鼠心、肝、脑组织MAPK活性变化及温补脾阳方药对其影响的实验研究 脾阳虚证大鼠心、肝、脑组织MAPK活性变化及温补脾阳方药对其影响的实验研究 2005年 第25卷 3月 第3期 河南中医 HENANTlRADIT10NALCHINESE,正DICINE March2005 Vl01.25No.3 脾阳虚证大鼠心,肝,脑组织MAPK活性变化及 温补脾阳方药对其影响的实验研究 崔家鹛.李德新.朱爱松 (辽宁中医学院,辽宁沈阳110033) 摘要:目的:探讨脾阳虚证MAPK细胞信号转导的规律.方法:饮食不节加上劳倦过度复合造模法塑造脾阳虚证动物模型. 采用免疫沉淀法检测心脏,肝脏及脑组织中MAPK活性.结果:脾阳虚证模型组大鼠肝脏和脑组织MAPK活性无明显变化; 心脏组织的细胞浆MAPK活性较正常对照组显着性升高(P<0.05);脾阳虚证治疗组肝脏组织的细胞浆MAPK活性较正常 对照组及模型组均显着性升高(P<0.01).结论:脾阳虚证状态下,机体各脏器组织MAPK参与的细胞信号转导发生不同的 改变.温脾阳方药对脾虚大鼠各组织MAPK活性存在不同的影响作用. 关键词:脾阳虚证;MAPK;温脾阳方药 中图分类号:R365文献标识码:A文章编号:10035028(2005)03—0029—03 丝裂原活化蛋白激酶(rnitogen—activatedproteinkinas— es,MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一,能对广泛 的细胞外刺激发生反应.多种细胞生理过程,如生长,发育, 分裂,死亡,以及细胞间的功能同步化等都涉及到MAPK信 号转导通路的调节J.同时,MAPK通路也是Ras,PKC, PKA,G蛋白,酪氨酸蛋白磷酸酶和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶等 多条信号通路的汇聚点.因此探讨脾虚状态下MAPK信号 转导通路的变化规律具有重要的意义.本项通过对脾虚证 大鼠心脏及脑组织MAPK活性变化规律的观察,探讨了脾 虚证细胞信号转导的规律,为进一步揭示脾虚证的病理实质 和健脾方药的作用机制提供了客观依据. 1材料与方法 1.1实验动物分组及造模 选用3月龄健康SD大白鼠30只(由辽宁中医学院实验 收稿日期:2005—01—20 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30171125);辽 宁省教育厅攀登项目(编号:20201056) 辽宁盖州人,博士学位,讲 作者简介:崔家鹏(1971,),男, 师. 动物中心提供),雌雄各半,平均体重195?20g.随机分为3 组:正常对照组,脾阳虚证模型组和脾阳虚证治疗组.造模 方法为目前公认的复合造模法,即饮食不节加上劳倦过 度.[] 1.2治疗及药物 从实验的第26天始至第90天止,对脾阳虚证治疗组给 予拟定温脾阳方药.给药剂量为成人单位公斤体重的10倍 量. 1.3主要试剂及仪器 主要试剂:髓磷脂碱性蛋白(MBP,购自Sigma公司),7 一 P—ATP(北京亚辉生物医学工程公司),考马斯亮兰蛋白 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),其它为国产 纯.主要仪器:MR1822型低温高速离心机(法国),Beckman LS一180液闪仪(USA). 1.4标本制备 实验第90天,20%乌拉坦麻醉,立即取心脏,肝脏及脑 组织,置于一70"C低温冰箱中保存.取0.1g上述组织,加入 0.6ml粉碎缓冲液(含2mMEDTA,10mMEGTA,20mM s/HClpH7,5,0.25M蔗糖),剪碎,匀浆,超声粉碎 (5次,间隔3秒,共10次),4"C15000rpm离心1h,上清 液为细胞浆蛋白. ? 29? 2005拄 第25卷 3月 第3期 河南中医 HENANTRADIT10NAI.CHINESE,DICINE March2005 V01.25No.3 1.5检测方法(免疫沉淀法)及主要程序 将20样品与含加BP(1rnm1)的25l激酶缓冲液 [20mr~1]LHEPES,pH7.2,10mmol/LMgC12,2mmol/L MnC12,2mr~1]LDTT,0.5mmol/LNaVO4,0.1mg/m~BSA, 2mn~l/L蛋白激酶抑制剂,2.0a7一P—ATP(1×106 epm)],30?震荡反应15min,取10反应液滴在Whatman PS1离子交换滤纸上晾干,用75mmol/L磷酸洗3次,每次 2min,取出吹干,将滤膜放入含10rnJ蒸馏水的液闪瓶中,以 Beckman闪烁计数仪测定其放射活性.MAPK活性以比活 性示.比活性表示30?时每毫克蛋白质每分钟催化7一 P—ATP掺入底物蛋白的pmol量. 1.6数据统计处理 所有数据用?S表示.实验结果采用SPSS软件11.0 版本进行处理.多组间均数比较采用单因素方差分析;组间 均数两两比较采用Ar,『0vA中的LSD多重比较方法. 2结果 2.1脾阳虚证大鼠心脏组织的MAPK活性变化 方差分析结果表明,脾阳虚证大鼠心脏组织的细胞浆 MAPK活性的变化有统计学意义.与正常对照组相比,脾阳 虚证模型组较正常对照组显着性升高(P<0.05).提示脾气 虚证状态下大鼠心脏组织中MAPK活性无明显变化,且温 补脾阳方药纠正脾气虚证状态过程中MAPK亦无明显变 化. APK活性变化 2.2脾阳虚证大鼠肝脏组织的M 方差分析结果表明,脾阳虚证大鼠肝脏组织的细胞浆 M(活性的变化有统计学意义.与正常对照组相比,脾阳 虚证模型组无明显变化(P>0.05).脾阳虚证治疗组较与正 常对照组及模型组均显着性升高(P均<0.01).提示脾阳 虚证状态下大鼠肝脏组织中MAPK活性无明显变化.但是 温脾阳方药能明显升高脾阳虚证模型组大鼠肝脏组织的细 胞浆MAPK活性,并使其显着性高于正常水平. 2.3脾阳虚证大鼠脑组织的MAPK活性变化 方差分析结果表明,脾阳虚证大鼠脑组织的细胞浆 MAPK活性的变化无统计学意义.与正常对照组相比,脾阳 虚证模型组及治疗组均无显着性变化(P均>O.05).提示 脾阳虚证状态下大鼠脑组织中MAPK活性无明显变化.温 脾阳方药亦不能明显升高脾阳虚证状态下大鼠脑组织的细 胞浆MAPK活性,并使其显着高于正常水平. 表1脾阳虚证大鼠心脏,肝脏及脑组织细胞浆MAPK活性比较 (?s)p~t/mg?min一 注:*表示与正常对照组相比P<0.05,**表示与正常对照 组相比P<001,??表示与脾阳虚证模型组相比P<0.01. ? 30? 3讨论 MAPK是一族在脊椎类动物体内广泛存在的蛋白质丝 氨酸/苏氨酸激酶,是信号从细胞表面传导到细胞核内部的 重要传递者J.作为生物体内重要的信号转导分子,在人体 各种组织的生理活动和病理改变过程中起着重要的作用,同 时也是以医药对病理状态进行干预的作用途径之一. MAPK在脾虚证病理过程中发生变化的可能机制包括 以下方面. 3.1参与脾虚证胃肠激素和某些细胞因子等细胞信号的传 递 许多胃肠激素包括胃泌素,生长抑素,P物质,血管活性 肠肽,缩胆囊素,屑动素,神经降压素,三叶肽等均被证实与 脾虚状态下胃肠异常运动及消化功能异常密切相关,其作用 机制与MAPK有关.目前已发现生长抑素抑制内皮素刺激 的平滑肌细胞增殖与其抑制MAPK的活性有关J.某些血 管活性肽和生长因子可以激活MAPK.胆囊收缩素对免 疫功能的调节也与MAPK通路有关].因此,脾虚证病理 状态下MAPK通路的改变可能与其转导某些参与脾虚证病 理改变的胃肠激素的信号有关. 3.2参与脾虚状态下的免疫调节机制异常的信号转导途径 现代研究表明,脾与细胞免疫,体液免疫,红细胞免疫, 局部免疫,免疫遗传和细胞因子活性均有密切的关系.林明 群等发现在细菌脂多糖在对巨噬细胞的免疫调变过程中 MAPK通路的改变是其作用机制之一L6.关崇芬等在研究 中发现,利血平脾虚小鼠脾淋巴细胞胞浆中及质膜上的酪氨 酸蛋白激酶比活性均显着低于正常水平,而复健治疗显示四 君子汤能明显提高脾虚小鼠胞浆中FrK的活力,并认为 其作用机制可能与激活MAPK通路有关.上述证据表明, 脾虚证MAPK活性变化可能与其转导免疫调节的相关信号 有关. 3.3参与脾虚证活性氧信号的转导过程 研究表明脾虚证时,机体抗氧化能力降低,抗氧化酶活 性下降,积累过剩的氧自由基,破坏生物膜的结构和功能,从 而造成机体组织和脏器的损伤.而Guyton等报道MAPK 体系具有拮抗氧自由基,减轻脂质过氧化的作用. 迄今关于中药作对MAPK信号转导途径的作用及其机 制方面的研究不多.王京滨等发现中药半边旗中二萜类化 且 合物5F作用于K562细胞使MAPK活性增强,表达增多,有量效关系,是其抗肿瘤疗效的作用机制之一J.有学者在 实验中证明中药红花黄色素对血管平滑肌细胞的增殖有抑 制作用,可能是通过抑制PKC依赖的MAPK信号转导途径 而发挥作用n.聂亚雄等在研究中药方剂脑溢安脑出血疗 效机制时,发现其对MAPK信号转导通路起着良性的调节 作用,并认为这为中药治疗脑出血疗效机理找到了的新的亮 点n.管冬元等在研究不同治疗方法对实验性肝癌的作用 机理时,发现不同治法能够针对性地调节癌基因radMAPK 信号转导通路上一些不同信号分子的转录水平. 25卷第3 本项研究表明.脾阳虚证状态下大鼠肝脏,脑组粤{中 MAPK活性无明显变化.而心脏组织中MAPK活性明显升 高.在温脾阳方药的干预下,肝脏组织中MAPK活性明显 升高,而心脏及脑脏组织中MAPK活性未发生明显变化. 提示中医脾气虚状态下MAPK信号转导通路在大鼠不同组 织中发生不同的变化,而温脾阳方药在纠正脾阳虐状态过 程中是通过对不同组织中MAPK信号转导通路的不同调节 效应而发挥其治疗作用的.本课小组以往的研究表明,本 次实验所使用的温脾阳方药具有很好的抗氧化能力,可以降 低过氧化脂质古量,提高抗氧化酶的活性.因此本组健脾方 药可能是通过MAPK信号转导途径来调控活性氧信号的转 导,进而达到减轻脾虚证中自由基氧化损伤的治疗敢果.其 具体转导路径.有待进一步研究. 参考文献 [1]吕爱平,李德新,刘春明,等脾虚三证模型大鼠睹质过氧化损伤 的比较[J]中国申西医结合消化杂志.2000,9(2):45—74,78. [2]s曙R,Kret~EG.TheMAPKlscade[J]FASEBJ+ 1995,9(9):726. [3]秀华.庞永政生长抑寨抑制内皮索刺激的家兔血管平精肌细 胞增殖[J].基础医学与临床,l996.16(5):33 胨光辉,胡厚祥丝裂紊活他置自激醇与心肌重构_J]屋外压学? 1998,18(3):217 [5]孟爱宏胆囊收缩素对免疫功能的i曰节及信号转导机{刮[J]国外 医学?生理病理科学与临床分册.2002,20(2):162 [6]林研群,张宗集巨嚆细胞免疫调变信号IzKA--与PKC对 MAPK信号通路的调节[J]生物化学与生物物理,1999,31(6): 701. [7:关崇芬,沈华蛋白酷氨酸激酶与中医脾虚证研究[J]中国中医 药信息杂志,1996.3(11):14 [8:GKz.Activationofmitten—act~vat.dprote~klnase .Rolein.aa~ival[ollowlngoxidantry[J]JBch嗽 1996.23(8):42—4138. [9]王京滨,粱念盎,奠丽儿半边虞中二萜类化台轫5F对l(562细胞 MAPK话性,表达的影响[J]中国药理学通报.2002,18(3):294— 297 [103陆桀.胡群.张光粒黄色索抑制血管平青胍细胞增殖与3种 蛋白激酶的关系J]药学,2000.35(3):169. [11]囊亚雄,黎各群.襄梦石,等.脑溢安对出血性中风大鼠脑内蘑蘸 化蛋白激酶表述的影响rJj.湖南中医学院,2001,21(2):20. [12]臂冬元.鲁恒心,方肇勤不同中医治法对ras—MAPK信号道路 c10):36 ]中国中医基础医学杂志.21~02,8 (缩辑:李华) ? 3l?