血红蛋白变性与保护

血红蛋白变性与保护 1 1 1 1 1 1 2 李晓静 ,霍冠南 ,王 玮 ,黄琨 ,肖保林 ,洪军 ,穆萨维姆瓦赫迪 A. A( )1 河南大学生命科学学院 , 河南 开封 475000; 2 德黑兰大学生物化学与生物物理研究所 , 伊朗 德黑兰 ( )β 摘 要 :应用紫外 - 可见光分光光度法 ,研究了十二烷基硫酸钠 SD S导致的牛血红蛋白变性及 - 环糊精对血红蛋白与 SD S 变性过程的影响 。研究明 ,在蛋白质等电点以下不同 pH 的 PB S缓冲液中 ,蛋白变性一半所添加的 SD S浓度即 C呈一定的规律 m β β 性 ;- 环糊精对蛋白质与 SD S相互作用的变性过程有很大的影响 ,使得牛血红蛋白的 C值增大 ,说明 - 环糊精对于牛血红蛋白 m β 稳定性有一定的保护作用 ,并且 - 环糊精浓度越大 ,保护作用越强 。 关键词 :十二烷基硫酸钠 ;牛血红蛋白 ;紫外 - 可见光分光光度法 ;蛋白质变性与保护 3 D ena tura t ion an d Pro tec t ion of Hem og lob in 1 1 1 1 1 L I X iao - jing, HUO Guan - nan, W AN G W ei, HUAN G Kun, X I AO B ao - lin, 1 2HON G J un, M OO S AV I - M OVAH ED I a li - akba r ( 1 Co llege of L ife Sc ience, H enan U n ive rsity, H enan Ka ifeng 475000 , Ch ina; 2 In stitu te of B iochem istry )and B iop hysic s, Teh ran U n ive rsity, Teh ran, Iran ( ) A b stra c t: The in te rac tion of bovine hemoglob in w ith sod ium n - dodecyl su lfa te SD Sand the dena tu ra tion p roce ss β β () we re inve stiga ted by UV - vis sp ec trop ho tom e try in ab sence o r p re sence of- cyc lodextrin s - CD a t d iffe ren t pH va l2 β ue s a t 25 ?. R e su lts ind ica ted tha t- CD wa s emp loyed a s an an ti - dena tu ra tion agen t and the p ro tec tion aga in st p ro2 β te in dena tu ra tion enhanced w ith inc rea sing concen tra tion of- CD. ( ) Key word s: sod ium dodecyl su lfa te SD S; bovine hemoglob in; UV - vis sp ec tro scop y; p ro te in dena tu ra tion and p ro tec tion 表面活性剂与蛋白质相互作用的研究 , 一方面可以拓展表 [ 1 ] 1 实验部分 面活性剂在生物技术和医药等领域的应用 , 另一方面可以为 了解蛋白质与脂类化合物或荷尔蒙之类的小分子的结合提供有 1. 1 仪器和试剂[ 2 ] 价值的模型 ,因此 ,表面活性剂与蛋白质方面的研究多少年来 [ 3 ] 1. 1. 1 仪器始终非常活跃 。环糊精分子独特的结构性能和特点 ,使其成 [ 4 - 9 ] TU - 1901双光束紫外可见分光光度计 ,北京普析通用仪器 为超分子化学中最 重要的功能主体之一 。它在 合成化学 、 ()有限公司 ; 电子天平 ,奥豪斯仪器 上海 有限公司 ; 精密酸度计 分析分离化学 、药物科学 、催化化学 、食品和日用工业以及环境 PH S - 3C型 ,上海大普有限公司 。[ 10 - 17 ] 保护等方面有重要的应用 。由于 表面活性剂具有非极性 1. 1. 2 试剂的碳氢链 ,表面活性剂作为客体可以与环糊精形成包合物 。因 () β 牛血红蛋白 BH b, MW = 64500, Sigm a ; - 环状糊精 , 北 此环糊精具有了潜在的调节蛋白质 - 表面活性剂相互作用的能 ()京鼎国生物技术有限公司 ;十二烷基硫酸钠 ,生物 上海 有 力 。环糊精与 表 面 活 性 剂 相 互 作 用 的 研 究 日 益 受 到 人 们 的 重 限公司 ;磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠 ,天津德恩化学试剂有限公司 ;视 ,这是由于其在理论研究和实际应用方面有较大的价值 。在 以上试剂都为分析纯 。表面活性剂溶液中 ,加入环糊精后 ,表面活性剂的物理化学性质 分别配制 0. 1 mo l /L 的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液 ,混合 发生变化 ,环糊精对表面活性剂的临界胶束浓度影响以及包合 配制磷酸盐缓冲液 ,用 0. 1 mo l /L 的磷酸溶液和氢氧化钠溶液分 [ 18 - 21 ] β 作用的测量已有多种方法 。用紫外 - 可见光分光光度法 , 别调低 pH 和高 pH。牛血红蛋白 、- 环状糊精和十二烷基硫酸 利用紫外可见光 UV - W IN 软件光谱扫描法研究 SD S与蛋白质 钠溶液均用二次蒸馏水配制 。 作用过程以及环糊精对蛋白质的保护作用鲜有报道 。 1. 2 方法 本文利用紫外 - 可见光分光光度法研究 SDS对牛血红蛋白所有试验均在 TU - 1901 双光束紫外可见分光光度计上进 ()(β β )BHb的作用以及 - 环糊精 - CD 对牛血红蛋白与 SDS相互作 行 ,利用紫外可见光 UV - W IN 软件对 BH b在 220,700 nm 范围 用的变性过程的影响 ,从大量的实验数据出了其中的规律 。 内进行光谱扫描 ,利用滴定添加法向比色皿中逐步添加 SDS溶液 , BH b的等电点范围为 6. 8 ,7. 2,在等电点以下 ,缓冲液 pH = 6. 0、5. 5、5. 0、4. 5、4. 0,均采用相同方法得到 BH b的类似于图通过 BHb光谱图的变化间接表示血红蛋白与 SDS相互作用后结构 β 发生的变化 。研究 - 环糊精对 BHb与 SDS相互作用的变性过程 3的变性曲线 ,并将纵坐标吸光值作归零归一处理 ,使纵坐标表 (β ) 的影响时 , BHb溶液和不同量的 - 环糊精溶液混合在培养箱中 示蛋白变性程度 图 4。 37 ?条件下培养 1 h,然后再逐步添加 SDS溶液 ,进行测定 。 2 结果与分析 2. 1 SD S浓度对变性过程的影响 μ在比色皿中 ,始终添加 60 L 0. 1 mm 的 BH b溶液 ,使其终 μ浓度保持在 2 m。BH b在 pH = 5. 5 的 PB S缓冲液中的光谱扫 描图如图 1所示 。 图 4 不同 pH 条件下 BH b归一化变性曲线 若取 BH b变性程度达到一半时的所加 SD S浓度为变性浓度 () 用 C表示 ,由图 4曲线可得图 5。 m ( )图 1 BH b在 pH = 5. 5 的 PB S缓冲液中的光谱扫描图 25 ? 由图 1可以看出 ,吸收峰分别位于 405 nm 附近和 278 nm 附 近 ,因为血红蛋白中含有血红 素辅 基 , 而 血 红 素 辅 基 在 405 nm 图 5 pH 对 BH b变性浓度的影响 附近具有最大吸收 ,在 278 nm 附近有最大吸收主要原因是色氨 由图 5 曲线可知 , C在 pH 5 ,5. 5 左右达到最小时 , 低于 m ( ) ( ) ( )酸 Trp 、酪氨酸 Tyr、苯丙氨酸 Phe残基的侧链基团对光的 () BH b等电点 约 pH 7。由于缓冲液 pH 不同 ,使得溶液中 BH 构吸收 ,当向蛋白质溶液中加入表面活性剂后 , 往往导致蛋白质生 [ 22 - 24 ] 象也有差异 ,表面氨基酸残基所带电荷量也会不同 ,因此导致阴 色基团 紫 外 吸 收 光 谱 的 变 化 。每 次 向 BH b 溶 液 中 滴 加 离子表面活性剂 SD S与 BH b的相互作用的强度有所差异 ,导致 SD S溶液 ,然后进行光谱扫描 。得到不同 SD S浓度下 BH b的吸 C值的差异 。 m 收光谱曲线 。图 2是在 pH = 5. 5 的磷酸盐缓冲液中 ,不同浓度 β 2. 2 - 环糊精对蛋白质与 SD S相互作用对变性过程 SD S作用下的 BH b的光谱扫描图组合 。 的影响 β 利用相同的试验方法 ,研究 - 环糊精对蛋白质与 SD S相 互作用的变性过程的影响时 ,在缓冲液 pH 一样的条件下 ,可以 β () 得到不同 - CD 浓度时 BH b 的变性曲线 图 6 。图中从左到 右分别是 CD 浓度为 0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mm 的 BH b和 SD S 相互作用的变形曲线 。 ( )图 2 不同 SD S浓度下 BH b吸收曲线 pH = 5. 5 SD S在低浓度和 BH b 相互作用时 ,倾向于特有的静电力作 用 ,即阴离子 D S - 与带正电 荷的氨基酸残基相连 , 中和蛋白质 表面的电荷 ,使蛋白质表面静电荷数量大大降低 , SD S浓度继续 增大 , SD S疏水尾部进入蛋白质结构内部 ,导致蛋白质构象的变 [ 25 - 27 ] 化 ,即发生变性 ,蛋白质内部的疏水残基逐渐暴露出来 ,使 β 图 6 pH = 5. 5 , - CD 保护下 , BH b归一化变性曲线 () 得蛋白质在 278 nm 处的吸光值逐渐增加 图 3 。 () 由图 6 ,也可以得到不同 CD 浓度下 BH b的 C值 图 7。 m 大 ,保护作用越大 。 β 参考文献 为了更进一步比较不同 - CD 浓度下 BH b的变性过程 ,计 [ 1 ] Zhang Tian - xi, L iu H u i - zhou, Chen J ia - yong. Jou rna l of Chem c ia l 算出相邻 SD S浓度下 278 nm 的吸光值对 SD S浓度求导数 ,得到 Techno logy and b io techno logy, 2000 , 75: 798. β () 不同 - CD 浓度下的导数曲线 图 8。 L uca ssen - R eynde rs E H. A n ion ic Su rfactan ts : Physica l Chem istry of [ 2 ] () Su rfac tan t A c tion, Su rfac tan t Sc ience Se rie s Vo lum e ?. N ew Yo rk: M a rcel D ekke r Inc. , 1981: 109. [ 3 ] Godda rd E D , A nan thap adm anabhan K P. In te rac tion of Su rfac tan ts w ith Po lym e rs and P ro te in s. N ew Yo rk: CRC P re ss Inc. , 1993: 319. Kum a r, C. V. , B u ranaP raPuk, V. J. Am. Chem. Soc. , 1999 , 121: 4 262 [ 4 ] - 4 270. [ 5 ] Mo reno, E. , Co rtijo, M. , Gonaza le - jim enze J. Pha rm acca l, 1999 , 69: 8 - 15. β 图 8 不同 - CD 浓度下的变性曲线一阶导数 [ 6 ] Feng, X. Z. , L in, Z. , Yang, L. J. , B a i, C. L. Talan ta, 1998 , 47: 1 223 - 1 229. β 图中从左到右分别为 - CD 浓度为 0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、[ 7 ] Pan jeh shah in, M. R. , Bowm e r, C. J. B iochem. Pha rm aco l. , 1989 , 38: β 1. 0 mm的 BH b和 SD S相互作用一阶导数 ,可以看出 ,- CD 浓 155 - 159. β 度越小 ,变性过程越剧烈 ,反之 ,- CD 浓度越大 ,变性过程越缓 M acgrego r, R. B. , webe r, Q. N atu re, 1986 , 319: 773 - 781. [ 8 ] β 慢 。说明与没有 - CD 的参与下相比 ,环糊精推迟和抑制了蛋 H e, X. M. , Caner, D. C. , N a tu re, 1992 , 358: 209 - 215. [ 9 ] 白质的沉淀变性 。 Funa sak i. N. , O h iga sh i, M. , H ada, S. , N eya, S. L angm u l, 2000 , 16: [ 10 ] 2. 3 pH对变性过程的影响383 - 342. [ 11 ] Mwak ibe te, H. , C risan tinom , R. , B loo r, D. M. , W yn - Jone s, E. , 在缓冲液 pH = 4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0 缓冲液中也采用相同 Ho lzwa rth, J. F. L angm u l, 1995 , 11: 57 - 68. () 的方法研究 ,在每一个 pH 也得到了相同的规律 图 9。 [ 12 ] R amo s Cab rer, P. , A lva rez—Pa rrilla, E. , M e ijide, F. , Se ija s, J. L ang2 m u l, 1999 , 15: 5 489 - 5 498. [ 13 ] W ilson, L. D. , V e rra ll, R. E. L angm u l, 14: 4 710 - 4 718. [ 14 ] R ekha rsky, M. V. , M yhew, P. , Go ldbe rg, N. , Ro ss, P. D. , Yam a sho ji, Y. , Inoue, Y. J. Phys. Chem. B , 1997 , 101: 87 - 95. [ 15 ] D e L isi, R. , M ilio to, S. , M u ra to re, N. L angm u l, 2000 , 16: 4 441 - 4 448. [ 16 ] D e L isi, R. , M ilio to, S. , M u ra to re, N. J. Phys. Chem. B. , 2002 , 106: 8 944 - 8 953. β 图 9 不同 pH 值下 - CD 浓度对 C的影响 m [ 17 ] Mwak ibe te, D. , C ristan tino, D. M. , B loo r, E. , W yn - Jone s, Ho lzwanh, J. F. L angm u l, 1996 , 11: 57 - 60. β 为了进一步比 较 , 我 们 把 同 一 - CD 浓 度 下 , 不 同 pH 下[ 18 ] Mwak ibe t, H. , C ristan tino, R. , B loo r. D. M. , e t a l. L angm iu r, 1995 , 11: () BH b的变性曲线进行了比较 ,作出了 C- pH 关系图 图 10 。 m 57 - 70. [ 19 ] Sm ith, V K. , N dou, T. T. , D e la Pena, A. M. , e t a l. J. Incl. Chem. , ( ) 1991 10 : 471 - 482. [ 20 ] Junque ra, E. , A ica rt, E. , Ta rd jo s, G. J. Phys. Chem. , 1992 , 96: 4 533 - 4 541. [ 21 ] Saenge r W , M u ller F A. In t. Ed. Engl. , 1988 , 27: 393 - 402. [ 22 ] R u so. J. M. , Gonz61 ez - P6 rez, A. , P rie to, G, Sa rm ien to, F. In t. 1 , _B i2 o l. M ac romo l. , 2003 , 33: 67. [ 23 ] 陶慰孙 ,李帷 ,姜涌明. 蛋内质分子基础 [ M ]. 北京 : 高等教育出版 β 图 10 同一 - CD 浓度下不同 pH 对 C影响 m 社 , 1995: 238. [ 24 ] 吴丹 ,徐桂英. 光谱法研究蛋白质与表面活性剂的相互作用 [ J ]. 物β 可以看出 ,- CD 浓度一定时 , C随着缓冲液 pH 的变化规 m ( ) 理化学学报 , 2006 , 22 2 : 254 - 260.β 律与没有 - CD 参与反应时相似 ,在等电点附近 , pH 越小 , C m[ 25 ] Moo savi - Movahed i, A. A. , N aza ri, K. , Sabou ry, A. A. The rmo2 越小 ,但是 pH 继续降低 , C反而增大 。 m ch im. A cta, 1997 , 131: 302. H ak im e lah i, G. H. [ 26 ] Moo savi - Movahed i, A. A. Cham an i, Go to, J. Y. 3 结论 J. B iochem. , 2003 , 133: 93. ( ) [ 27 ] Moo savi - Movahed i, A. A. J. Iran ian Chem. Soc. , 2005 2 : 189. 在蛋白质等电点以下不同 pH 缓冲液中 ,蛋白变性一半所添 ( )β 加的 SD S浓度 C呈一定的规律性 ;- 环糊精对于牛血红蛋 m