使用16SrDNA序列
鉴定副溶血性弧菌
使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌 ?30?公共卫生与临床医学
20l06tPublicHealthandClinicalMedicineVolume6,Number1,Feb2010
使用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌
王宏萍,张继伦,吴文娟,姜婷,鲍依稀,周晓明
摘要:目的测试应用16SrDNA序列分析鉴定副溶血性弧菌的适用性.方法用16SrDNA基因的扩
增引物,对从腹泻者,水产品和环境中分离获得的副溶血性弧菌(n=39)及临床分离的15种(n=181)
常见菌的基因组DNA进行聚合酶链反应,产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后直接测序序列通过blastn,
在GenBank中比对,确定细菌属种并与
型法结果进行比较.结果220株菌(220/220)扩增出870bp
的目的片段,平均测序长度752bp.36/39株副溶血性弧菌鉴定结果与生化培养法相符,3株菌株分别
鉴定为科氏葡萄球菌(Staph3lococcuscohnii),表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和
Oceanobacillusprofundus.181株其它临床分离菌无误判为副溶血性弧菌,其中123株与生化培养法结
果一致,58株有差异结论本文
的16SrDNA基因序列分析可用于准确鉴定副溶血性弧菌,并
可与15种临床常见分离菌区分.
关键词:16SrDNA分析;副溶血性弧菌,;临床菌株
中图分类号:R378.3文献标识码:A
IdentificationofVibrioparahaemolyticusfromOtherClinicalIsolatedBacteriabyPartial
16SrDNASequencingWANGHong-ping,ZHANGJi—H,z.,wWenjuan,JIANGTing,BAO
M—xi3,ZHOUXiao—
minrDepartmentofepidemiology,Shanghaipublichealthclinicalcenteraffiliatedto FudanUniversity,Shanghai201508;2ShanghaiEntry—
ExitInspectionAndQuarantineBureau,Shanghai
200335;3Departmentofimmunology,ChongqingmedicalUniversity,Chongqing40001~China)
Abstract:ObjectiveToevaluatethefeasibilitytoemploy16SrDNAsequencingasatestforVibrio
parahaemolyticusidentification.MethodsVibrioparahaemolyticusstrains(n=39)wereindividuallyisolated
fromdiarrheapatients,fisheryproductsandenvironmentwatersamplesrespectively.Otherfifteenspeciesof
clinicalbacteriaisolates(n=181)wereincludedascontrols.BacteriagenomeDNAswereamplifiedbyPCR
withprimersdesignedforpartial16SrDNA.Then,amplifiedproductswerepurifiedfromagarose—gel
electrophoresis,directlySequencedbyBigDye3.0kit.SequenceswerecomparedwithdatabaseinGenBank
usingprogramblastnfortheidentificationofthebacterialspecies.Resultswerefurthercomparedwiththose
identifiedbyroutinebiochemistrytests.ResultsAllof220bacteriaisolatesweresuccessfullyamplifiedby
PCRwitha870bptargetfragment.The16SrDNAtestcanidentifythirty—
sixoutof39Vibrioparahaemoly—
ticusisolates(92-30%),inaccordancewiththeresultsdeterminedbyroutinebiochemistrytest.Noneof181
otherclinicalbacterialisolateswasclassifiedasVibrioparahaemolyticusby16SrDNAtest,although41of
themwerenotconsistantwiththeresultsfrombiochemistrytest.ConclusionsThesedatasuggestedthat16S
rDNAtestcanpreciselyidentifyVibrioparahaemolyticusfrommostofcommonclinicalisol
ates.
Keywords:Diagnosis;16SrDNAtest;Vibrioparahaemolyticus;Identification
收稿日期:2009-08.06;修回日期:2009—09.16
基金项目:上海市科委技术标准专项资助(06DZ05029);上海申康医院发展管理中心科研共享平台资助
作者单位:1上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心流行病学部,上海201508;2上海市出入境检验检疫局,上海
200335;3重庆医科大学免疫学教研室,重庆400016
通讯作者:周晓明(1969.),男(汉族),江苏省苏州市人;南京大学生物化学系本科,学士学位;中科院上海细胞生物学
研究所获硕士学位;香港大学医学院获博士学位;副研究员,讲师,先后主持复旦大学青年基金课题1项,上海市科委课
题3项,国家自然科学基金和国家"863"重大课题各l项;获上海市科技进步一等,二等奖各1项.主要研究方向:分子流
行病学.
冰论着冰
公共卫生与幅床医学20106卷1划PublicHealthandClinicalMedicineVolume6.Number1.Feb2010?31?
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)广泛
存在于近海岸海水和贝壳类,鱼虾类等海产品中,
是引起日本,美国,台湾等沿海地区细菌性食物中
毒的首要原因.上海的细菌性食物中毒事件中副溶
血性弧菌的分离率为63.7%_J'引.因此,准确鉴定水
产品中的副溶血性弧菌是食品卫生现场监督,维持
食品安全,保障社会消费水产品安全的重要工作.
核糖体RNA(rRNA)是细菌分型鉴定可用的
标志物之一,常使用16SrDNA的基因序列的差异
进行分型.该基因序列全长约1.5kp,由可变区和保
守区交替组成,包含一定的种问多态性.为建立副 溶血性弧菌检测的技术标准,我们测试使用16S rDNA分型对副溶血性弧菌进行鉴定,并测定其与 临床分离的常见其它菌株的区分度.
材料和方法
1.1菌株来源副溶血性弧菌:2006年11月到 2007年9月之问分别从上海市金山区和浦东新区的 腹泻患者,水产品和水样标本中分离得到,由上海 市出入境检验检疫局提供;临床分离菌株:2006年 l0月到2008年3月之间由上海市公共卫生临床中 心检验科分离的临床常见菌株,经生化培养法鉴定 为15种181株.
1.2生化培养鉴定法菌株经平板划线,37?培养 18-24h,革兰氏染色,观察细菌菌落形态以及显微 镜镜检下细菌形态;使用ATBTM鉴定条或VitekGNl, GPI鉴定卡(ATBExpression药敏分析系统和 VITEK32d~型全自动微生物鉴定系统,法国生物梅 里埃公司)确定菌种的生化培养型.
1.3细菌基因组DNA提取从血平板挑取适量菌 落混于200gLTE溶液(10mMTris'Cl,1mMEDTA,
pH8.0),使用UNIQ.10柱式细菌基因组DN时由提试剂 盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)依照操作
提取细菌基因组DNA.简述为依次)JH/~.400pL 裂解液~D3gL蛋白酶K溶液,裂解细菌释放基因组 DNA,离心取上清加入UNIQ一10吸附柱,使用洗涤 液去除杂质,用ddH2O洗脱,获得30,50pL细菌基因 组DNA,浓度约为0.02—0.05gg/pL. 1.416SrDNA序列扩增使用16SrDNA的弓1物, 正向序歹0为:5'一cCAGcAGCCGCGGTAATACG一3'
表1J6SrDNA比对鉴定结果与生化培养法鉴定有显着差异的菌株 Table1Thestrainwithdifferentassessmentresultsbytwodifferentmethods
生化培养法鉴定结果数量16SrDNA鉴定结果比对相似度 覆盖度(%)(%)
大肠埃希菌
Escherichcoli
肺炎克雷伯菌
KlebsieUapneumoniae
铜绿假单胞菌
Pseudomonsaaeruginosa 嗜麦芽窄食单胞菌
Stenotrophomonasmaltophilia 金黄色葡萄球菌
Staph2,lococcusaureus 溶血性葡萄球菌
Staphylococcushaemolyticus 人葡萄球菌
Staphylococcushorninis 表皮葡萄球菌
StaphyloCOCCUSepidermidis 木糖葡萄球菌
Staphylococcusxylosus 星座链球菌
Streptococcusconstellatus 粪肠球菌
Enterococcusfaecalis 屎肠球菌Enterococcusfaecium 计
弗氏志贺菌肋igellaflexneri
志贺菌属Shigellasp.
普通变形杆菌Proteusvulgaris
赫氏埃希菌Escherichhermannii 产酸克雷伯菌Klebsiellaoxytoca KlPbiellavariicolla
产气肠杆菌Enterobacteraerogenes 阴沟肠杆菌把,口6nc把rcloacae
大肠埃希菌Escherichiacoli
膝状假单胞菌Pseudomonasgeniculata 膝状假单胞菌Pseudomonasgeniculata 不动杆菌属Acinetobactersp.
纹带棒状杆菌Corynebacteriumstriamm 里昂葡萄球菌Staphylococcuslugdunensis 马胃葡萄球菌Staphylococcusequorum 志贺菌属某个种鼬igellasp
Lysinibacillussphaericus 金黄色葡萄球菌Staphy[ococcusaureus 溶血性葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus Lysinibacillussphaericus 粪肠球菌Enterococcus向ecalis
Lysinibacillussphaericus 大肠埃希菌Escherichiacoli
中间链球菌Streptococcusintermedius 希氏肠球菌Enterococcushirae En~rocDccusdevriesei
唾液链球菌Streptococcussalivarius 鹑鸡肠球菌EnterococcusgaUinarum 屎肠球菌Enteroeoccusfaecium 粪肠球菌Enterococcusfaecalis 1oo
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公共卫生与临床医学2010年第6卷第1期
PublicHealthandClinicalMedicineVolume6.Number1.Feb2010.33.
(参考序YlJGenBankaccessionnumber:X56580,位 置在528,547bp处)[31,反向序列为:5'-AGGCC CGGGAACGTATTCAC一3'(位置在1397,1378bp 处)l4J.聚合酶链反应(PCR)条件为50gL反应体 系,4细菌基因组DNA做模板,510x缓冲液(含 MgC12),4gL2.5mMdNTP,0.25儿5U/~LrTaq酶 (TaKaRaTaq,宝生物工程有限公司,大连), 20gM正反向引物各lbtL,ddH2O补足体系.扩增条 件为起始94~C变I~4min,接着反应30个循环(94~C 30s,58.C30s,72.Clmin),终末72?延~7min. 以ddH2O做空白对照.产物取5作琼脂糖凝胶电泳 (0.8%,5V/cm,40min).
1.5扩增产物测序PCR产物由上海生工生物工 程技术服务有限公司测序(测序试剂为BigDye~ Terminatorv3.1CycleSequencingKit),测序引物使 用正向扩增引物.测序结果用ChromasPro校正后, 在NCBI网站(WWW.ncbi.nlm.nih.gov)进行blastn比 对查询.
1.6判断标准Blastn中待测的细菌序列与参考序 列的相似性?99%的比对结果确定为相应属种. 2结果
16SrDNA保守区基因扩增,220株菌(220/220) 扩增出870bp的目的片段,空白对照为阴性.电泳 位置正确(图1).
16SrDNA测序比对结果,220株菌平均测序长 度为752bp(438,818bp).92.30%(36/39)株副溶 血性弧菌鉴定结果与生化培养法一致,不符合的3 株副溶血性弧菌分别鉴定为科氏葡萄球菌
(Staphylococcuscohnii),表皮葡萄球菌
(Staphyrlococcusepidermidis)和Oceanobacillus profundus.123株(67.96%)临床分离菌与生化培 养法鉴定结果一致,其中3株奇异变形杆菌,7株 图116SrDNA扩增片段
Fig.1Amplificationfragmentof16SrDNA
1:分子量标记D2000;2:空白对照{3—7:16SrDNA目的片段 鲍氏不动杆菌的鉴定结果均符合临床生化培养法; 41株(22.65%)与生化表型鉴定结果有差异(表1); 17株(9.39%)的最佳匹配菌属及次匹配菌属不能 相互区分于生化表型法.
3讨论
环境中约5%的副溶血性弧菌是致病的,95%是
不致病的.大肠埃希菌,志贺氏菌,普通变形杆菌, 葡萄球菌等也是食源性疾病相关的细菌,其腹泻患 者的炎症反应与副溶血性弧菌感染菌者相似.因此, 判断海产品的食用合格性需要准确鉴定5%的致病 菌并与上述混杂菌群相区分.
由于细菌生长条件的差异,株系之间的生化代 谢型差异较大,会产生不小于属种之问的距离.此 外,生化培养法鉴定细菌需时较长(3,7d).因此 用于细菌的最终鉴定效度会低于16SrDNA序列分 析方法.
我们对41株副溶血性弧菌及181株临床分离的 非副溶血性菌株比较了16SrDNA序列测定分型与 生化培养法的鉴定结果.实验数据显示92.30% (36/39)的副溶血性弧菌鉴定在两种方法中一致, 不相符的3株来源腹泻患者分离菌株,分别鉴定为 科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii),表皮葡萄球 菌(Staph)'lococcusepidermidis)和Oceanobacillus
profundus.181/181株经生化代谢培养方法鉴定的 临床分离菌株在16SrDNA分型中无误判为副溶血 性弧菌的例证(图2).
181株临床分离菌株中,32%(58株)的16S rDNA鉴定结果与生化培养法有差异.具体差异类型 为4株(4/30)大肠埃希菌经16SrDNA基因鉴定为 志贺属菌(3例志贺菌属某种,1例弗氏志贺菌);2 株(2/30)鉴定为普通变形杆菌.大肠埃希菌与志 贺菌属的DNA相关性为80%90%_7J,但肠侵袭性大 肠埃希菌(EIEC)与志贺菌的生化性状几乎相同' ,因此只能通过16SrDNA基因区分.
5株(5/23)肺炎克雷伯菌经16SrDNA鉴定分
别为产气肠杆菌,阴沟肠杆菌,产酸克雷伯菌(2
株),Klebsiellavariicola.克雷伯菌与产气肠杆菌的
DNA同源性为50%,59%J,16SrDNA基因
(1290bp)相似性为97.5%,99.0%[】.'?].产气肠杆
菌会出现动力和鸟氨酸脱羧酶阳性延迟反应
(2,5d),因此标准的生化鉴定(24h)会将其误鉴
定为肺炎克雷伯菌【l?.
16SrDNA基因不能区分金黄色葡萄球菌与溶
血性葡萄球菌,粪肠球菌与屎肠球菌及铜绿假单胞
.34.公共卫生与临床医学20106卷1驯
PublicHealthandClinicalMedicineVolume6,Number1,Feb2010 (上接第14页)
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