孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用

孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用羊膜穿刺和绒毛吸取是目前常用的产前诊断技术，但其操作具有创伤性，可导致宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等,1,。建立非创伤性产前诊断，降低产前诊断的风险，是产前诊断工作的一项重大课题。自50年代从孕妇外周血中发现胎儿细胞后，学者们开始关注这类细胞在产前诊断中的应用价值，但因技术条件的限制，这一非创伤性诊断方法进展缓慢。直至80年代中期，随着胎儿细胞分离技术的日趋成熟和分子生物学、细胞遗传学诊断技术的迅猛发展，这一产前诊断方法才有了新的突破，并成为近十年来众多学者研究的热点，现综述如下。1胎儿细胞的特征和消长规律1.1类型目前从孕妇外周血分离到的胎儿细胞有滋养叶细胞、淋巴细胞和有核红细胞(NRBC)。因滋养叶细胞体积大、容易在肺组织滞留;淋巴细胞出现晚，存活时间长(半年,27年)，在下次妊娠时妇女血液中可再次出现,2,，其应用价值不大。NRBC是用于产前诊断最理想的胎儿细胞，它有如下特征:(1)可在妊娠早期出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断,3,;(2)可表达出特殊的抗原成分，便于富集;(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定,4,;(4)携带胎儿全部基因组，便于遗传学和分子生物学。1.2抗原性胎儿细胞的抗原性是鉴定、富集胎儿细胞的生物学基础，现已证实，胎儿NRBC有4种特殊的抗原成分:转铁蛋白受体(CD71)、凝血酶敏感蛋白受体(CD36)、糖蛋白A(GPA)和红细胞膜蛋白,5-7,。最近Steele等,8,又从孕妇外周血中发现HLA-GmRNA基因信号，提示HLA-G很可能是胎儿NRBC的另一抗原标志。1.3消长规律探讨胎儿细胞的消长规律有助于选择产前诊断的最佳时间。Tomas等,9,发现人工受精的妇女血液检出Y染色体特异性序列的时间为4周零5天，最迟50天，首次检出的平均时间为6周?4天，消失时间为产后2个月。Simpson等,10,研究发现，从孕妇外周血分离胎儿NRBC的最佳时间为妊娠后10,18周。马旭等,11,发现19例妊娠男胎妇女外周血Y染色体锌指蛋白基因(ZFY)在妊娠6周、11周、14周时的检出率分别为5.3%、68.4%和95.0%，同时还发现妊娠女胎的妇女外周血无1例ZFY假阳性，提示分离胎儿NRBC进行产前诊断的最佳时间为妊娠14周。1.4含量胎儿NRBC含量高低关系到产前诊断的准确性。众多的研究表明，胎儿细胞与母体在细胞之比为1?5000,1?20000，其中胎儿NRBC的比例在1?105,1?109之间。从理论上，只要有理想的富集、分析方法，胎儿NRBC含量完全可以满足诊断需要。2胎儿细胞的富集纯度和产量是衡量胎儿细胞富集效力的两个重要概念，纯度是指分离后样本内胎母细胞百分比，产量是指实际获得的胎儿细胞数，不同方法对富集胎儿细胞的纯度和产量有很大影响，现就现有的富集方法分述如下。1密度梯度离心法利用聚蔗糖与泛影酸钠混合物作分离介质，加至孕妇血中离心，根据细胞密度的差异分离出胎儿细胞。该法简便易行，但胎儿细胞的纯度和产量不高。宋杰等,12,用此法分离胎儿细胞预测胎儿性别的灵敏度和特异度分别为84.85%和96.77%，总符合率为90.63%。2γ珠蛋白阳性选择法胎儿血红蛋白主要为HbF，而成人为HbA。HbF由两条α珠蛋白和两条γ珠蛋白链组成;HbA由两条α珠蛋白和两条β珠蛋白链组成。利用抗γ珠蛋白的单克隆抗体通过流式细胞计数仪可富集胎儿NRBC。Zheng等,3,证实83%,100%抗γ珠蛋白阳性细胞为孕妇血液中的胎儿细胞。3荧光激活细胞分类法又称流式细胞计数仪分离法。先制备单核细胞悬液，用荧光素激活胎儿NRBC，利用流式细胞计数仪将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来。Bianchi等,5,用荧光素标记抗CD71、CD36、GPA抗体后分离胎儿NRBC，再用PCR进行Y染色体序列分析，发现单独用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度分别为57%和88%，而单独用抗GPA或同时使用抗CD71、CD36富集胎儿NRBC诊断胎儿性别的准确度为100%。Wachtel等,14,和国内学者李智等,15,研究也有相似的结论。提示使用的抗体不同对分离胎儿细胞的纯度和产量有很大影响。4磁性激活细胞分类法利用磁珠吸附胎儿NRBC，在磁场作用下将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来，包括以下两种方法。4.1磁场正相富集又称磁场阳性富集。孕妇血液经密度梯度离心制备单细胞悬液，加入磁珠标记的单克隆抗体与胎儿NRBC结合，在磁场作用下阳性吸附NRBC，洗涤并振荡后获取胎儿NRBC。该法简便易行，但富集胎儿NRBC的含量和纯度不高。4.2磁场双相富集孕妇血单细胞悬液中加入CD14和CD45单克隆抗体，使之与淋巴细胞和非红细胞单核细胞结合，再加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附并去除淋巴细胞和非红细胞单核细胞(反相富集或阴性选择);剩余物中加入CD71单克隆抗体，使之与胎儿NRBC反应，再次加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附胎儿NRBC(正相富集或阳性选择)，洗涤振荡，获取胎儿NRBC。该法虽操作复杂，但获取的胎儿NRBC产量和纯度很高。Steel等,8,运用该技术可从18ml孕妇血液中获取3×104个胎儿NRBC，胎母细胞比在1?3000,4?3000之间。3临床应用现已从基因和染色体水平对孕妇外周血胎儿细胞作产前诊断。在基因水平主要是用PCR鉴别胎儿性别、研究胎儿β-地中海贫血、Rh血型和HLA多态性。在染色体水平主要是用荧光原位杂交(FISH)诊断21三体、18三体、Klinefelter综合征和47，XXY等染色体病。1预测胎儿性别用孕妇外周血胎儿细胞Y染色体PCR分析预测胎儿性别始于1989年,16,。4年后，Lo等,17,又报道了用妊娠早、中期原血作Y染色体序列分析的结果，发现7例男胎有6例预测正确，6例女胎有5例预测正确，只要300000个母体细胞中含有1个胎儿细胞，就能成功地预测胎儿性别。现已证实，胎儿NRBC经GPA抗体吸附磁场分离后，PCR预测胎儿性别的准确度和特异度可达100%,5,。目前国内的研究和应用也日趋成熟，已有许多成功的先例,12，18,，接近国际先进水平。2预测Rh血型多数情况下，Rh(D)阴性源于1号染色体Rh(D)基因缺失，若从Rh阴性血液中检出Rh(D)基因，则提示胎儿Rh血型阳性。Lo等,19,用妊娠晚期母体原血预测胎儿Rh血型取得成功。最近Geifman-Holtzman等,20,发现，妊娠早期母体血液富集胎儿NRBC后，用PCR预测Rh血型的特异度和敏感度分别为100%和84%，运用该法判断Rh(D)血型时常会出现血清学与PCR结果不符的问题。一方面，无Rh(D)抗原表达的人仍可能持部分Rh(D)基因片段，若扩增选在该区域内，会出现假阳性结果;另一方面，有人虽能表达Rh(D)抗原，但当扩增区域位于缺少的外显子内或样品不含胎儿细胞时，则出现假阴性结果。3诊断单基因遗传病1990年Camaschells等,21,最早用孕妇外周血诊断胎儿β-地中海贫血/HbLepor病获得成功。他们对3例高危孕妇在妊娠8,10周的血液进行11号染色体Lepore突变基因PCR分析，发现2例预测正确，第3例孕妇血液Lepore基因阴性，其丈夫携带正常的Hb基因。从理论上讲，只要能够建立有效的胎儿细胞富集技术和PCR手段，许多单基因病的非创伤性产前诊断都能迎刃而解。4诊断染色体病br1991年Price等,22,首次用胎儿细胞诊断出1例18三体妊周孕妇血液分离胎儿NRBC，用X、Y和18号染色体专一性探娠。作者用妊娠10针作FISH，发现胎儿NRBC大部分出现以上3种染色体杂交信号，后经绒毛活检证实诊断正确。