09%生理盐水

09%生理盐水 材料: PBS溶液，0.9%生理盐水, DMEM， 器材: 剪刀，烧杯，保温瓶， 原代细胞的取材 一、取材的基本要求 (1)取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4?存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4?存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 (2)取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素(400单位/mL)甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4?下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌的器皿或事先消毒好的带少许培养液(内含400单位/mL抗菌素)的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 (3)取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 (4)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 (5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 (6)原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 原代细胞的分离和制作 人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下: 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 ( 二、实体组织材料的分离方法 (一)机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸 管吹打分 散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。 (二)消化分离法 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下: (,)胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开(胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。 ?细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效( ?酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)( 分离方法如下: ?过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4?过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。 (,)胶原酶(Collagenase)消化法 适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用(可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1,0.3mg/mL。 2、非酶消化法(EDTA消化法) 常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好( 消化分离法的操作步骤: (1)剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。 (,)加液漂洗 将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜，自然沉降法)。 (3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37?水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。 (4)弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。 (5)漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。 (6)机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细 胞悬液进行分瓶培养。 原代细胞的培养方法 1、组织块培养法 (1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。 (2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20,30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37?温箱内。 (3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 2.消化培养法 该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等) 去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。 3.悬浮细胞培养法:对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、 胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养， 或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 原代和传代细胞的培养和维持 一、原代细胞的培养与维持 1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养) 凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%,80%(在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。 贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。 2、悬浮细胞的培养 凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及 白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞(若要将淋巴细胞及白血病细胞进 行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血 清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明 细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次(换液时尽量使细胞不丢失)， 待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。 悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式( 二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture) 这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5,10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞(或称传代细胞系)。传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。应注意如下几点: (1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。 (2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。 (3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤。 (4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。 (5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%,20%左右。 三、传代细胞的传代培养 (1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基(以25mL培养瓶为例)。 (2)每瓶加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。 (3)每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液)，轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2,3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。 (4)加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保 所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免 细胞的机械损伤( (5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。 四、传代细胞的建系和维持 1.细胞档案 细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性(由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜 (分裂指数)，细胞的特殊存病毒等)、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间 遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。 2.换液传代 (1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。 (2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉(每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。 3.细胞系(或株)的鉴定和管理 细胞的纯化和克隆 细胞培养常用培养基有:DMEM(高、中、低糖)，M199，IMEM，BME，CMRL，Ham'sF10/F12/F14,MEM,RPMI1640和细胞培养用相关试剂:细胞冻存培养基，血清，胰蛋白酶EDTA消化液，TNS胰蛋白酶中和液，DPBS,HBSS缓冲盐，P/S青链霉素，L-谷氨酰胺等等。 细胞消化中的胰蛋白酶和EDTA: 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。胰酶在pH 8.0、37?时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。 细胞传代使用的胰酶浓度是0(25,或0(2,。用于原代细胞培养消化组织块则为0(1,或0(125,; EDTA溶液:EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌 长白猪精原细胞的分离和纯化 材料和方法 1 实验动物 长白种系公猪,2月龄,由北京养猪中心苇沟现代化猪场提供。取活体睾丸,立即放入1640营养液中,待分离细胞。 2 主要试剂及材料 胶原酶(,,,,,,,,,),胰蛋白酶(,,,,,),脱氧核糖核酸酶(,,,,,,,,,,,,,),牛血清白蛋白(,,,,中国医学科学院天津血液研究所),胎牛血清(,,,,,,,;,),,,,， 1640培养基(,,,;,,临用前配制,加链霉素及青霉素至终浓度分别为100,, ,及80，, ,,,调,,至7 3),其他化学试剂均为国产分析纯。800,,容量的细胞沉降池(定做)。实 验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。 3 石蜡切片的制备及染色 新鲜睾丸除去包膜及白膜,切取0 5,1 0;,3左右的小块,立即置入,,,,,固定液中,4?固定24,。按常规步骤制作石蜡切片,,,染色。 4 单细胞悬液的制备 无菌操作置睾丸于,,,溶液中,小心切开包膜,除去脂肪、附睾及白膜,切取1,左右睾丸组织,用弯剪剪成1,,3大小的碎块,移入离心管,加5,,含0 5, ,胶原酶的,,,,33?温育15,,,,其间不断震摇并用吸管吹吸数次。静置4,5,,,,待组织和细胞沉降管底后,弃上清。重复上述步骤1次。加入5,,含0 5, ,胰蛋白酶和1 0,, ,,,,,,的,,,,33?,温育15,,,,吸管轻轻吹打3,,,直至滴片镜检时视野中全是散在的单细胞及少量小的细胞团。1000, ,,,离心10,,,,弃上清,并用,,,清洗两次,细胞沉淀最后重悬在含0 5%,,,的,,,中,100目筛网过滤,制成单细胞悬液并进行细胞计数。 5 细胞的沉降分离 固定沉降池并保持水平状态,池底下口周围加数十粒硅化玻璃珠。10,,,,,及10,,待分离的单细胞悬液按先后从底部下口载入沉降池。用1640培养液分别配制4%和2%的,,,溶液各250,,,同时分别倒入梯度发生器的两个容器中。梯度发生器出液口直接用橡胶软管连接于沉降池的底部尖嘴下口。打开活塞,调整流速,使,,,溶液以15,, ,,,的速度从底部进入沉降池(图1)。最终沉降池内的液体从上而下形成2%,4%的,,,连续梯度。整个沉降系统4?静置3,,以使细胞按不同大小在,,,连续梯度介质中通过自然重力沉降而分层。分层后的细胞溶液从沉降池底部下口用自动收集器收集,控制流速为5,, ,,,,10,, 管作为1份。1000, ,,,离心10,,,,沉淀细胞,弃上清。细胞重悬于0 5,,含0 5%,,,的1640培养液中。将各管细胞分别滴片,,,染色,光学显微镜下检测细胞的形态结构特征及均一程度,以确定细胞的类型及纯度。合并同类细胞,取1滴细胞悬液,加10μ,0 4%台盼蓝,计细胞总数及死亡细胞百分比。最后调整细胞浓度为106个 ,,。滴片,染色。显微镜下任选5个视野,计算细胞纯度。 6 细胞的贴壁培养及纯化 经沉降分离的精原细胞中混有少量支持细胞及间质细胞,将此细胞悬液接种到一次性无菌培养瓶中,于37?、5%,,2及饱和湿度等条件下培养6,8,,支持细胞和间质细胞贴壁而精原细胞尚未贴壁,轻轻摇动培养瓶使精原细胞充分悬浮,吸出培养液,显微镜下再次检测细胞纯度及数量,并计算均值。 结果和讨论 1 石蜡切片的观察 在400倍光学显微镜下观察2月龄未成熟公猪的睾丸组织石蜡切片(图2)。此时的睾丸组织主要为间质及刚刚发育的曲细精管。间质组织主要由间质细胞组成;曲细精管上皮主要由紧贴基膜的精原细胞以及支持细胞组成,两者均由原始精原细胞分化而来,尚未见初级精母细胞。从切片可见2月龄猪曲细精管尚未发育形成管腔。 2 重力沉降分离后的细胞分类及纯度 未成熟猪睾丸组织的单细胞悬液经,,,连续梯度沉降分离后,根据其形态特征可将收集的细胞合并为4类。第2,15份合并为第?类细胞,20,33份合并为第 ,44份合并为第?类,46,50份合并为第?类。它们的主要组成、细胞?类,38 纯度及活细胞比例等详见附表。其中第?类为我们所要的精原细胞,纯度达到91%(图3)。附表 重力沉降分离后的细胞类别及纯度,,,,, :,,,,,,,:,,,:,,,,,,，,,,:,:,,,,,,,,，,,,::,,,,,,,,,,,,,,:,类别,,.细胞组成;,,,,纯度(%),,,,,,(%)存活率(%),,,,,,,,,(%)?细胞团(;,,,;,,,,,)—95?精原细胞(,,,,,,,,,,,,,)9197?支持细胞(,,,,,,,;,,,,)9597?细胞碎片及非细胞结构(;,,,,,,,,)—— 本实验中所获得的第?类组分属于一种直径只有2,3μ,的非细胞结构物质,着色较深,无细胞核及胞质内含物。,,,,,,等在分离幼年小鼠的生精细胞时也分离到类似结构和特征的物质,并命名为;,,,,,,,,。我们在分离成年小鼠及猪的睾丸生殖细胞时也得到了此类物质,说明它的存在在猪和鼠之间没有动物种属和发育阶段的特异性。其来源、功能及超微结构尚未见报道。3 贴壁培养后的细胞纯度 间质细胞和支持细胞在体外培养时容易贴壁。我们将,,,重力沉降分离后获得的精原细胞(其中少量的杂细胞主要为支持细胞,还有个别间质细胞)接种于培养瓶中,6,8,后,支持细胞和间质细胞贴壁生长而精原细胞仍呈悬浮状态。利用此选择性贴壁法可将精原细胞进一步纯化。收集悬浮精原细胞并经,,染色,在光学显微镜下任选5个视野,细胞纯度分别为93%、94%、96%、93%及95%。平均值为94 2%。高于沉降分离后91%的纯度。 4 光学显微镜下2月龄猪睾丸组织各类细胞的形态学鉴定 显微镜下可见精原细胞呈圆形或卵圆形,直径11,13μ,,胞质少,核大,核内常染色质占多数,近核膜处由2,4个核仁。支持细胞外形不规则,胞质多且着色浅,核小,核内染色质少,近核膜处染色质较多,1,2个核仁,培养时先于精原细胞贴壁,贴壁后铺展成梭形或多角形,上述细胞形态特征与2月龄猪睾丸组织石蜡切片的细胞形态完全一致。我们曾采用不同的方法及介质用于幼年猪精原细胞的分离,试图找到一种最佳分离方法。本实验方法的建立,对获得哺乳动物高纯度的生精细胞,进一步深入研究精子发生的分子机制以及分离和培养生精干细胞等方面都有重要的参考价值。