维生素C对视黄酸受体γ基因作用的初探

维生素C对视黄酸受体γ基因作用的初探 维生素C对视黄酸受体γ基因作用的初探 江苏农业科学2009年第3期--——279--—— 维生素C对视黄酸受体基因作用的初探 张冬杰 (黑龙江省农业科学院畜牧研究所,黑龙江哈尔滨150086) 摘要:采用半定量RT—PCR方法研究在体外培养的猪成纤维细胞内添加不同浓度维生素C后视黄酸受体基 因(RA研)的达变化情况.结果表明:维生素C可显着抑制研基因的表达,但是不同浓度组间差异不显着. 关键词:猪;成纤维细胞;维生素C;视黄酸受体基因;RT,PCR 中图分类号:$813.1文献标志码:A文章编号:1002—1302(2009)03—0279—01 视黄酸是维生素A在体内的主要活性代谢物,是公认的 分化诱导剂,它不仅在正常胚胎发育中调节细胞分化,而且可 以诱导许多肿瘤细胞发生分化….视黄酸主要通过细胞核 膜上的视黄酸受体介导来调节细胞分化,目前认为视黄酸受 体有两类:RAR(retinoicacidreceptor)类和RXR(retinoicacid Xreceptor)类,每类各有0【,p,3个亚型,其中RAR类受体在 介导细胞分化中起主导地位,RXR类受体仅起辅助作用. 维生素C作为机体必不可少的一类维生素,虽然不会与视黄 酸受体直接发生作用,但是由于它与维生素A之间存在相互 作用关系,因此推测它可能是通过影响其受体的表达来影响 维生素A的转运和发挥功能.本研究在mRNA水平上分析 了维生素C可能对RARy基因的表达调控作用. 1与方法 1.1大白猪成纤维细胞的体外培养 大白猪的成纤维细胞为本试验室保存的细胞系,本试验 将该细胞在42?水中快速解冻,复苏,并传代培养至第3代, 待细胞生长至70%一80%汇合时,分别加入维生素A,使其 终浓度依次为0,0.5,5,1O,3Og/l,分别作用12,24,42,78 h的时分浓度收获细胞. 1.2半定量RT—PCR反应 RARy 1.2.1细胞总RNA的提取及cDNA合成按照《分子克隆》 介绍的方法进行细胞总RNA的提取,并使用BcaBESTRNA PCR试剂盒将所提取的RNA反转录成cDNA,一2O?保存. 1.2.2引物设计根据GenBank上所提交的研基因序 列(U82629)和一actin基因序列(U07786)设计引物,引物序 歹0女口下:R—F为5一GGGCAAATACACCACGAA一3, R.y—R为5一CAGCAAAGGCAAAGACGAG一3,actin — F为5一CGGGACCTGACCGACATCCA一3,actin—R 为5一GGGCCGTGATCTCCTTCTG一3. 1.2.3半定量RT—PCR反应使用混合建立每对引物 的最佳反应条件,使用Bio—Rad公司生产的凝胶成像系统进 行目的条带的积分光密度值(IOD)读取.最终结果为研 mRNAIOD值与口一actinmRNAIOD值之比. 1.2.4数据分析所得数据使用SAS6.12进行统计分析. 2结果 在体外培养的猪成纤维细胞内添加了终浓度为0.5,5, 10,30l的维生素C,分别作用12,24,48,72h后发现,与 对照组相比,维生素C可显着抑制nARy基因的表达,而且不 同浓度组间差异不显着.琼脂糖凝胶电泳图及数据分析结果 见图1和图2. l=0:2=0.5~tg/gl;3=5Ixg/rd:4=10Ixg//dl:5=30~tg/rtl 图l添加不同浓度的维生素c后RARy表达变化情况 3讨论 RAR是视黄酸诱导增强子,属于类固醇/甲状腺的核受 收稿日期:2008—12—22 基金项目:黑龙江省博士后基金(编号:LRB07—392). 作者简介:张冬杰(1980一),女,黑龙江哈尔滨人,博士,助理研究员, 主要从事动物分子遗传研究.Tel:(0451)86657928;E—mail: djzhang8109@163.tom. 2.5 0 02.0 1.5 1.0 凸0.5 0 0 2000 1000 750 500 250 l0O 直OO.55lO3O 维生素C浓度(1) 图2添加不同浓度的维生素c后见t表达量 (下转第280页) ?—— 280?-——江苏农业科学2009年第3期 高锰酸钾对金鱼鱼种的急性毒性试验 王凡,郭向萌 (洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022) 摘要:采用常规生物急性毒性的试验方法,研究高锰酸钾对金鱼鱼种[金鱼体长(5.4?0.3)cm,体重(10.1? 0.3)g]结果显示:高锰酸钾对金鱼鱼种24h,48h,72h,96h的半致死浓度(MTL)分别为4.34mg/L,3.06mg/L,2.49 mg/L和2.31m#L,安全浓度为0.231nag/L,高锰酸钾对金鱼药浴浓度须低于常规用量. 关键词:高锰酸钾;金鱼;鱼种;半致死浓度;安全浓度;毒性试验;鱼病防治 中图分类号:$965.842.22文献标志码:A文章编号:1002—1302(2009)03—0280—02 随着物质生活水平的提高,人民更加重视精神生活,观赏 鱼的养殖因而得到迅速了发展.金鱼品种繁多,色彩丰富,性 情温和,体制继壮,对水质的适应能力较强,且容易繁殖,价格 也比较便宜,观赏价值也很高,因而受到世界各地水族爱好者 的青睐. 观赏鱼一般都经过长期驯化变种而来,比较娇贵,所处环 境相对稳定,一旦管理不善,容易引起疾病.与其他观赏鱼一 样,金鱼在大面积苗种培育,家庭养殖和水族箱养殖的过程 中,不可避免地会有疾病的发生.目前国内常见水产药物大 多数只是停留在对食用鱼的研究,如高锰酸钾对虹鳟J,草 鱼,丁岁的研究.目前有关高锰酸钾对观赏鱼金鱼鱼种 的毒性研究还未见报道,因此本研究进行了高锰酸钾对金鱼 鱼种急性毒性的试验,可为金鱼及相关观赏鱼的鱼病防治工 作提供参考依据. 1材料与方法 1.1试验用鱼 试验用金鱼鱼种采自洛阳师范学院生命科学系试验基 地.规格为体长(5.4?0.3)cm,体重(10.1?0.3)g.试验 收稿日期:2008—11—11 作者简介:王凡(1976一),男,江苏邳州人,硕士,讲师,从事渔业水 环境方面研究.E—mail:wangfan7677@163.con. 用鱼在室内水族箱驯养3d以上,暂养期间活动正常,无病 害,死亡率低于5%;试验前1d停止投饲,选择体格健壮,大 小基本一致,反应灵敏的鱼种进行试验;试验期间不投饲. 1.2试验药物及试验条件 试验药物:高锰酸钾(分析纯)购自拜耳农药生物公司. 试验用水为曝气3d以上的自来水.水质指标:pH值 0.1;DO7.85mg/L;总硬度(6.56?0.21)mmo]/L;水 7.9? 温(18?2)?. 试验容器:直径22cm大小均一的塑料盆,试验加水4L. 1.3试验方法 试验设计:采用换水生物法测试.根据相关资料进行预 实验从而确定正式试验的上限和下限.在此区间内按公式 … 厂[, r=确定为5个浓度梯度组和一个对照组,每一浓度0 组均设两个平行组,每试验组随机放10尾金鱼.试验液每隔 24h更换一半,及时剔除死亡个体.试验开始后,前8h做连 续观察,在曝露的过程中观察它们的行为,中毒症状以及死 亡效应.以后每隔2—3h定期观察.若发现多次刺激无反 应的个体可判断为死亡个体,及时从水中捞出.各组试 验鱼24h,48h,72h和96h的死亡数,计算平均死亡率,再 转化为概率单位,计算出试验液浓度的对数,求出概率单位数 与试验液质量浓度对数的回归方程,然后根据公式可求出高 锰酸钾24h,48h,72h和96h的半致死浓度LC.和安全 (上接第279页) 体超家族.第3个受体是视黄酸受体基因(础脚),最先在 鼠中发现,主要在皮肤中检测到它的RNA.氨基酸序列比较 分析发现,RARa,和RART在种间的保守性远高于同一 物种内3个受体的保守性,这一研究结果说明,RAR的3 个亚型可能行使着不同的功能.肼聊在人和鼠的皮肤中都 是优势表达的RAR.视黄酸可以增加RARy基因的表达,但 作用效果不如基因明显.本研究结果表明,维生素 c可显着抑制RARy基因的表达.有报道称,当机体发生维 生素A中毒症状时,摄入一定量的维生素c则可缓解中毒症 状.这说明维生素c可抑制维生素A的吸收和转运,本研究 结果在分子水平上验证了这一结论.据此推测,维生素c是 通过抑制视黄酸受体基因的表达来阻止维生素A的转运. 参考文献 [1]王尔松,高解春,杨毅,等.视黄酸受体基因在人胚肾上腺及神 经母细胞瘤中的表达[J].复旦:医学版,2002,29(3):157— 160. [2]NapoliJL.Biochemicalpathwaysofretinoidtranspoa,metabolism, andsignaltransduction[J].ClinicImmunolImmanopalhol,1996,80 (3):s52. [3]KrustA,KastnerP,PetkovichM,eta1.Athirdhumanretinoieacid receptor,hRAR—gamma[J].ProcNatlAcadSciUSA,1989,86 (14):5310—5314. [4]CroweDL,HL,GudasLJ,eta1.Variableexpressionofretinoieacid receptor(RARbeta)mRNAinhumanoralandepidermalkeratino- cytes;relationtokeratin19expressionandkeratinizationpotential [J].Differentiation,1991,48(3):199—208.