【doc】共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽及其性能检测

【doc】共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽及其性能检测 共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽及其性 能检测 亿亏与生物互程2008,Vo1.25No5 Chemistry&Bioengineering 共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽及其性能检测 宋刚,干信 (湖北工业大学生物工程学院,湖北武汉430068) 摘要:对魔芋飞粉发酵液中的甘露聚糖肽进行了初步的提取分离.高效液相色谱检测结果明,糖肽中的糖成分 由甘露糖和葡萄糖聚合而成,二者的比值为o.6l;SDS-PAGE凝胶电泳测定结果表明,糖肽的分子量分布在lO,4O kDa.与魔芋飞粉相比,甘露聚糖肽的氨基酸含量有所增加,但必需氨基酸占总氨基酸的比例变化不大. 关键词:甘露聚糖肽;魔芋飞粉;检测 中图分类号:TQ922文献标识码:A文章编号:1672—5425(2008)05—0039—04 甘露聚糖肽由不同链长的甘露聚糖肽分子构 成],是具有一定均一性的混合物,不含单糖,双糖等 小分子糖类和游离的氨基酸.临床及动物实验, 甘露聚糖肽在动物水平和细胞水平上均可以起到抑制 肿瘤生长和促进免疫系统的作用,是一种新型的免疫 促进剂. 魔芋飞粉是含高蛋白,低甘露聚糖的十分难得 的资源,其中含全糖48.75[淀粉17.O2,水溶 性糖分(甘露糖和葡萄糖)8.95,水溶性还原糖 2.46],蛋白质23.8,应用前景广阔_2].但直 接从魔芋飞粉中提取甘露聚糖肽的研究至今仍是 空白.作者在此采用共生发酵魔芋飞粉制备甘露 聚糖肽,用高效液相色谱和氨基酸自动分析仪分别 检测了其糖成分和氨基酸成分,并用SDS一聚丙烯酰 胺凝胶电泳确定了其分子量的大小. l实验 1.1材料,试剂与仪器 魔芋飞粉,魔芋系鄂品种花魔芋,恩施向发魔芋制 品有限公司;枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,米曲酶 Aspergillusoryzae均为湖北工业大学保藏菌种. 1一苯基一3一甲基一5一吡唑啉酮(PMP),NaOH,甲醇, 盐酸,硫酸,三氟乙酸,柠檬酸钠,NaC1,茚三酮,冰乙 酸,蒽酮,乙腈,硫酸铜,酒石酸钾钠,碘化钾,均为国产 分析纯. CR21G型高速冷冻离心机,日立株式会社;LC- 6A型高效液相色谱仪,日本岛津;RC38—1K型透析 袋,上海绿鸟公司;D2F一6020型真空干燥箱,上海精宏 国 实验设备有限公司;L-8800型氨基酸自动分析仪,日 本日立公司. 1.2方法 1.2.1预处理 采用两菌共生发酵的方法对魔芋飞粉蛋白进行预 处理,利用两种菌自身的蛋白酶系降解魔芋飞粉,使结 构紧密,难溶于水的魔芋飞粉蛋白转化为结构疏松,可 溶于水的可溶性糖肽. 在两菌发酵工艺优化过程中,选取菌种比例(米曲 霉和枯草芽孢杆菌的种子液比例,下同),发酵温度,接 种量,发酵时间等4个因素,每个因素取3个水平进行 L.(3)正交实验,优化指标为蛋白酶酶活.同时,根据 两菌的共生发酵单因素实验结果,固定转速为200r? rain,,发酵基质pH值为8.0,装液量为50mL. 1.2.2沉淀法提取可溶性糖肽 魔芋飞粉发酵液经4?,8000r?rain高速冷冻 离心去菌体,取上清液,搅拌加人(NH).SO达到一 定饱和度(控制加人时间约为2h).然后置于冰箱中 过夜沉淀.再经4?,10000r?rain冷冻离心去除 上清液,沉淀用2OmLpH值为8.0的0.05tool?L Tris—HCl缓冲溶液溶解清洗. 1.2.3透析 将Tris—HC1缓冲溶液溶解的沉淀装人透析袋进 行透析.用蒸馏水作为透析液,透析3,4次.直到透 析液中检测不出沉淀为止_3]. 1.3分析与检测 1.3.1甘露聚糖肽的定性检测 糖成分的定性检测采用蒽酮比色法_3;肽成分的 收稿日期:2007ll—l4 1983一作者简介:宋刚(),男,湖北武汉人,硕士研究生,研究方向:分子食药生物工程; 通讯联系人:干信,教授. 宋刚等:共生发酵魔芋飞粉甘露聚糖肽的制备及性能检测/2008年?5一 定性检测采用双缩脲法[3]. 1.3.2甘露聚糖肽的定量检测 1.3.2.1糖成分的检测 葡萄糖(甘露糖)标准曲线的绘制:分别取0.01 mg?mL的葡萄糖(甘露糖)标准液1L,2L,4 L,6L,8L,10L进样,以峰面积为纵坐标,葡萄 糖(甘露糖)浓度为横坐标,绘制标准曲线. 色谱条件:色谱柱C.;流动相:重蒸水一乙腈(76 :24);检测波长:250nm;进样体积:1OL;体积流 量:1.0mL?min,;柱温:35?. 糖肽的水解:取1mL样液和1mL4mol?L三 氟乙酸,于沸水浴中水解3h,得水解液. 样品的衍生化标记L4]:向水解液中依次加入0.5 mol?LPMP甲醇溶液5OL和0.3mol?L NaOH20L,混匀后置于7O?水浴中加热反应3O min,取出,室温放置10min;再加入0.3mol?L盐 酸2OL中和,放入真空干燥箱中于6O?下烘干,烘 干后的物质用2mL水及2mL氯仿溶解,充分振荡 后,去除有机相(下层),重复3次. 1.3.2.2分子量的测定L5 样品处理:将标准蛋白质和待测样品分别溶于2 mg?mL蛋白质处理液,在沸水中加热3,4min,待 冷却后进行点样. 点样:微量注射器吸取标准蛋白质样品液3L注 入样品槽内的浓缩胶面上,同时吸取待测样品液 10L注入样品槽. 电泳.力?样完毕,两槽注入电极缓冲溶液,接通电 源,调节电流为15mA,当指示剂进入分离胶后,加大 电流到30mA,电压恒定在8O,100V,约3,4h后, 指示剂达到距前沿1,2cm时,终止电泳. 染色:取出凝胶板,加入染色液染色2h. 脱色:将胶放在脱色液中脱色0.5h,每隔0.5h 换1次脱色液,换3次,待蓝色基本脱掉,放在脱色液 里浸泡至蛋白质谱带清晰为止. 1.3.2.3氨基酸成分的检测L6 氨基酸成分用氨基酸自动分析仪按GB/ T5009.124—2003进行检测. 2结果与讨论 2.1最优发酵工艺条件的确定 L.(3)正交实验因素和水平见表1,结果与分析 见表2. 由表2可知,各个因素对蛋白酶酶活的影响大小 依次为:菌种比例>发酵时间>接种量>发酵温度,最 优为A:D3C.B,即菌种比例1:2,发酵时间 36h,接种量5mL,发酵温度37~C. 表l Tab.1 正交实验因素和水平 Thefactorsandlevelsoforthogonaltests 通过正交实验,以蛋白酶酶活为优化指标,得到两 菌共生发酵魔芋飞粉制备甘露聚糖肽的最佳工艺条件 为:37?下,米曲霉和枯草芽孢杆菌的种子液以1:2 的菌种比例和1O的接种量(5mL)接种到pH值为 8.0的发酵基质(含4魔芋飞粉)上,200r?min摇 床发酵36h. 2.2甘露聚糖肽的定性检测 将样品分成两份,一份滴加蒽酮试剂检测,样 液呈蓝绿色,说明其中含有糖类物质;另一份滴加 双缩脲试剂检测,样液呈紫红色,说明其中含有类 似于双缩脲的结构,即肽键结构.因此,样品属糖 肽类物质. 2.3甘露聚糖肽糖成分的检测 2.3.1甘露聚糖肽单糖成分分析(图1) 一酶一的"?沿硌.洲l墨?仇仇 一一.一...一,,一一一鹕蟾一c一...'g一一验一一0一一一B一...一,一,一一 A一222333堋目一号一2一验一23456789hbbR,一鞋一..hbbR 宋刚等:共生发酵魔芋飞粉甘露聚糖肽的制备及性能检测/2oo8年囊5明 ManGlu 0510时闻i52005101520时闻 /min 图1标准甘露糖,葡萄糖和糖肽酸水解PMP衍生物的高效液相色谱图 Fig.lHPLCChromatogramsofPMPderivativesofs~ndardMan,Gluandacidhydrolysateso fglycopeptide 由图1可知,样品糖肽酸水解PMP衍生物在 9.746min和18.970min分别出现两个峰,其出峰时 间与标准甘露糖和葡萄糖的出峰时问(甘露糖:10.673 min,葡萄糖:20.236min)基本一致.由此推测,糖肽 中的单糖包括甘露糖和葡萄糖. 2.3.2葡萄糖和甘露糖的标准曲线(图2) 25 20 15 旧 髫l0 5 0 浓度/mg?mL 图2葡萄糖和甘露糖的标准曲线 Fig.2StandardcurvesofGluandMan 甘露糖的标准曲线回归方程为::2×10一 26763,R.:0.9991;葡萄糖的标准曲线回归方程为Y 一8×10.一17912,R.:0.996.由样品的出峰面积 对照标准曲线可知Man:Glu:0.61. 2.4甘露聚糖肽的分子量测定 将甘露聚糖肽组分进行冷冻浓缩后,用SDS— PAGE检查其纯度并测定分子量分布.甘露聚糖肽的 SDS—PAGE电泳结果见图3. 97400D? 66200D 43000D 3l000D MarkSample 图3甘露聚糖肽的SDS-PAGE凝胶电泳结果 Fig.3TheSDS-PAGEgelelectrophoresisresultofmannopeptin 由图3可知,甘露聚糖肽的分子量范围约为10, 40kDa. 2.5甘露聚糖肽氨基酸成分的检测(表3) 表3 Tab.3 氨基酸成分自动分析结果 Autoanalysisresultsforaminoacids 由表3可知,魔芋飞粉含有的氨基酸种类与文 献_7中甘露聚糖肽所含氨基酸的种类基本一致.魔芋 飞粉除色氨酸外,含有人体所需的其余7种必需氨基 酸(即蛋氨酸,赖氨酸,亮氨酸,苯丙氨酸,异亮氨酸,缬 氨酸,苏氨酸),约占氨基酸总质量的32.05.魔芋 飞粉经过发酵之后,氨基酸含量有所增加,由438.20 _————————————————————一宋剐等:共生发酵魔芋飞粉甘 露聚糖肽的制备及性能检测/2008年囊5啊 mg?(100mL)提高到627.12mg?(100mL)_.,必 需氨基酸含量由140.45mg?(100mL)提高到 190.81mg?(100mL)_.,但其占氨基酸总量的比例 变化不大. 3结论 采用两菌共生方法发酵魔芋飞粉,并采用盐析沉 淀法对魔芋飞粉发酵液中的甘露聚糖肽进行了初步的 提取分离.高效液相色谱测定结果表明,样品糖肽的 糖成分是由甘露糖和葡萄糖聚合而成,其中甘露糖和 葡萄糖的比值为0.61;经SDS—PAGE凝胶电泳测定, 甘露聚糖肽的分子量范围为10,40kDa;甘露聚糖肽 与魔芋飞粉相比,其氨基酸含量有所增加,但必需氨基 酸占总氨基酸的比例变化不大. 参考文献: [1]林琳,吴荣聪,王钊,等.多抗甲素的药理研究进展[J].中国药理 学通报,2002,18(4):374—378. [2]冲增哲,着,薄颖生,译.日本魔芋主栽品种及其特性[J].陕西林 业科技,2001,(3):79—82. [3]陈钧辉,陶力,李俊,等.生物化学实验[M].北京:科学出版社, 2003:59. [4]王赛贞,林树钱,林志彬,等.灵芝多糖肽中单糖的组成[J].中草 药,2007,38(2):174—176. [5]赵永芳.生物化学技术原理及其应用(第二版)[M].武汉:武汉大 学出版社,1994;105—107. [6]GB/T5009.124—2003.食品中氨基酸的测定[s]. [7]李雷斌,傅仕洪,施伟领.多抗甲素的研究进展及其在养猪生产上 的应用前景[J].饲料工业,2004,25(6):33—35. StudyonPreparationofMannopeptinbySymbiosisFermentationof KonjacFlyingPowderandDeterminationofItsPerformance SONGGang,GANXin (SchoolofBo,Pc^oZog.y,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068,China) Abstract:Mannopeptinwaspreliminarilyextractedandseparatedfromfermentationliquoro fkonjacflying powder.HPLCdeterminationresultsindicatedthatthesaccharidecomponentofmannopepti nwaspolymerized bymannitoseandglucosewitharatioof0.61.SDS— PAGEgele1ectrophoresisresultsshoweditsmolecular weightdistributionwasfrom10kDato40kDa.Comparedwithkonjacflyingpowder,mannopeptinhadarela— tivelyhighaminoacidcontent,butitsproportionofnecessaryaminoacidstototalaminoacidsdidn'tchangeob— viously. Keywords:mannopeptin;konjacflyingpowder;determination (上接第34页) StudyonSynthesisofCopper(H)ComplexofEthanolamine-3,5-Dibromosalicylaldehyde SchiffBaseandItsBiologicalActivityasMimicEnzyme LIUZheng,JINLi.xia,YONGShu (DepartmentofMaterialandChemicalEngineering,GuilinUniversityofTechnology,Guilin541004,China) Abstract:Bysolutionmethod,3,5-dibromosalicylaldehydeSchiffbaseanditscopper(II)complexwerede— signedandsynthesized.andtheirstructuresweredeterminedandcharacterizedbyIR,UVandTGanalyses. Takingthecatalyticactivityastarget,theoxidationreactionsofascorbicacidbyhydrogenperoxidewereex— plored,whichwerecatalyzedbycopper(II)complexesofthreekindsof3,5-dibromosalicylaldehydeSchiffba— sesincludingethanolamine一 3,5-dibromosalicylaldehydeSchiffbase,aminomethylsulfonicacid一3,5-dibromo— sa1icy1a1dehydeSchiffbaseandtaurine一 3,5-dibromosalicylaldehydeSchiffbase,respectively.Theresultsshowed thatallthecopper(II)complexeshadcatalyticactivityashorseradishperoxidase,andtheorderofactivitywas complexofethanolamine:>complexofaminomethylsulfonicacid:>complexoftauri ne.Thekineticsofabovere— actioncatalyzedbycopper(II)complexofethanolaminewerestudiedandthecatalyticmechanismwasprelimi— narilydiscussed. Keywords:Schiffbase;complex~mimetichorseradishperoxidase;activityofimitatedenzyme;kinetics