IL1β诱导大鼠肝细胞NO产生增多线粒体膜电位降低.doc

IL1β诱导大鼠肝细胞NO产生增多线粒体膜电位降低.doc IL 1β诱导大鼠肝细胞NO产生增多线粒体膜电位降低 【摘要】 目的: 观察体外培养的大鼠肝细胞在促炎细胞因子IL 1β刺激下一氧化氮(NO)的产生和线粒体膜电位的变化，探讨两者之间的关系。方法: 原位胶原酶灌注法分离和培养原代大鼠肝细胞后，分别用生理盐水、脂多糖(LPS)(10 mg?L-1)、IL 1β(1 nmol?L-1)及LPS(10 mg?L-1)联合IL 1β(1 nmol?L-1)刺激肝细胞，并分别在刺激后6、12、24、48 h留取细胞和上清液，采用分光光度法测定上清液NO的含量，采用荧光探针JC 1结合流式细胞仪检测肝细胞线粒体膜电位的变化。结果: IL 1β刺激后肝细胞产生NO增加而线粒体膜电位降低，两者均呈时间依赖性，并在24 h达峰值;LPS对肝细胞NO的合成没有直接诱导作用，与IL 1β联合刺激也没有协同作用。结论: IL 1β诱导肝细胞过度产生NO从而抑制线粒体呼吸功能可能是炎症应激下肝损伤的潜在机制之一。 【关键词】 肝细胞; 线粒体;白细胞介素1β; 一氧化氮; 膜电位;大鼠 肝功能障碍是脓毒症患者常见的临床现，也是导致脓毒症患者并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)及死亡的重要原因[1]。近年来发现，线粒体功能障碍导致的机体能量代谢异常可能在脓毒症向MODS的发生和发展过程中发挥了关键的作用[2 5]，脓毒症时肝脏产生大量NO抑制线粒体呼吸功能可能是其潜在的损伤机制[6 7]。IL 1β是脓毒症早期炎症反应过程中释放的一种促炎细胞因子，在体外能够诱导肝细胞NO合酶(iNOS)基因的表达，促进NO的产生[7 8]。以往的实验多通过ATP浓度或线粒体酶复合物活性来间接反映线粒体的功能[4，6 7]，本研究旨在体外观察IL 1β对大鼠肝细胞NO产生的影响，通过肝细胞线粒体膜电位的变化，从总体水平反映线粒体的功能，并探讨两者间的关系。 1 与方法 1.1 实验材料 内毒素大肠杆菌O111:B4型(Sigma公司，美国)，重组大鼠IL 1β(PeproTech公司，美国)，RPMI 1640培养基(GIBCO公司，爱 尔兰)，小牛血清(民海生物工程有限公司，中国兰州)，?型胶原酶(Invitrogen公司，美国)，DNase?(Sigma公司，美国)，6孔培养板(Griner公司，美国)，NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)，JC 1荧光探针(Molecular Probe公司，美国)。 1.2 肝细胞的分离和培养 肝细胞分离采用本实验室改良的原位两步灌注法[9]:选取6周龄雄性SD大鼠(180,220 g)，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后，腹部备皮碘伏消毒，作5,6 cm的腹正中切口，用7号头皮针管行门静脉及下腔静脉腹腔段置管，建立肝脏灌注回路，结扎下腔静脉胸腔段，第1步用含0.5 mmol?L-1 EDTA的D Hanks液以20,40 ml?min-1的速度灌注5,10 min，去除肝脏血液，当下腔静脉流出液体变清后，第2步用含有?型胶原酶的消化液进行循环灌注消化，消化液配方为100 ml Hanks液+50 mg ?型胶原酶+8 mg DNase?,当肝脏变软、肝包膜出现皱缩破裂说明消化充分，取出肝脏剪成碎块置入RPMI 1640培养基中，260目金属滤网过滤后，低速离心(50×g共5 min)，反复洗涤3次可获得高纯度的原代肝细胞。通常可获得肝细胞总量为(1,2)×108个，细胞活力大于50%，纯度高于90%。将获取的肝细胞以1×106 ml-1的浓度种植于6孔培养板中，每孔加入2 ml细胞培养液，细胞培养液配方为RPMI 1640培养基+100 U?L-1青霉素+100 μg?L-1链霉素+0.3 mg?ml-1 L型谷氨酰胺+0.16 U?ml-1胰岛素+10%小牛血清。 1.3 实验分组 肝细胞在5% CO2 的37 ?培养箱培养48 h后换新鲜培养液，换液后单孔细胞数量约为1×106个，选8块6孔培养板共48孔细胞，分成4组，每组12孔，分别用生理盐水(NS)、血清脂肪酶(LPS)(10 mg?L-1)、IL 1β(1 nmol?L-1)和LPS(10 mg?L-1)加IL 1β(1 nmol?L-1)处理，并分别在处理后6、12、24和48 h留取细胞检测线粒体膜电位，同时检测细胞上清液NO含量。 1.4 NO的检测 利用NO遇氧和水生成硝酸盐和亚硝酸盐的原理，通过反应体系将样本中的NO转化为硝酸盐，再采用分光光度法(DU800型分光光度计，美国Beckman公司)测定硝酸盐的含量，可间接测知NO的浓度，具体参照NO检测试剂盒说明书进行操作。 1.5 肝细胞存活率及线粒体膜电位的检测 将取下的肝细胞用PBS重悬，取一小滴于计数板上采用台盼蓝拒染法计算肝细胞存活率，其余2 000 r?min-1离心5 min，弃掉上清，加入1 ml含有1 μl JC 1浓缩液的孵育缓冲液，在5% CO2 的37 ?细胞培养箱中孵育15 min，1 500 r?min-1离心5 min，弃掉上清，再将细胞重悬于1 ml不含JC 1的孵育缓冲液中，用流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)进行分析，激发波长为488 nm，每个样本获取10 000个细胞，以红色荧光(聚合体)的强弱代表线粒体膜电位的高低，强红色荧光细胞比例越大说明细胞线粒体总体膜电位越高。 1.6 统计学处理 不同刺激物组在任一时间点都取3孔细胞进行检测，计量结果以x-?s表示，采用SPSS 11.5统计软件包进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 细胞存活率的变化 除了LPS加 IL 1β组在刺激后24 h细胞存活率有明显降低外，各组细胞在刺激后6、12、24 h存活率与NS组比较无显著差异;在刺激后48 h除NS组外，其余各组细胞存活率均显著降低(表1)。 2.2 IL 1β对大鼠肝细胞NO合成的影响 生理盐水和LPS刺激肝细胞后，NO的合成随着时间的延长略有增加，但变化趋势平缓;IL 1β刺激后，NO的合成明显增多，其促进NO合成的作用随着时间的延长而增强，并在刺激后24 h达到最高峰;LPS和IL 1β同时刺激，肝细胞NO的合成明显增多，但与IL 1β刺激组比较没有显著差异(图1)。表1 不同刺激物对大鼠肝细胞存活率的影响(?s) 2.3 IL 1β对大鼠肝细胞线粒体膜电位的影响 不同刺激物组肝细胞线粒体膜电位都随着时间的延长逐渐降低，在刺激后24 h IL 1β组和IL 1β加LPS组线粒体膜电位显著低于NS组和LPS组，在刺激后48 h各组线粒体膜电位水平没有显著性差异(图2)。3 讨 论 脓毒症患者容易发生多器官功能衰竭而死亡，其发病机制目前尚未明确[1]。早在10年前，Kantrow等[10]就通过实验证明了脓毒症机体的氧代谢异常并不是因为组织缺氧而是由于组织对氧的利用发生了障碍，这一现象后来被Fink[5]命名为“细胞病理性缺氧(cytopathic hypoxia)”。正常情况下机体总氧耗的90%是被线粒体消耗用于合成机体所需的能量物质——ATP，因而组织利用氧的能力下降可能与线粒体呼吸功能受损有关，近年来大量的研究已经证实了这一观点[4，6 7]。组成线粒体呼吸链的酶复合物同时具有质 子泵的功能，在进行电子传递的过程中不断地将H+泵到膜外，从而在线粒体膜内外形成了一个内负外正的电势差，即线粒体的膜电位。当线粒体呼吸链的酶受到抑制或膜的通透性增加，会导致H+泵出减少或回流增多，线粒体膜电位就会降低。因而线粒体膜电位是反映线粒体功能状况的良好指标[11]。JC 1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染剂，能够自由通过细胞膜，并依赖于线粒体膜电位向线粒体内聚集，膜电位高进入线粒体的JC 1就多，并以发出红色荧光的聚合体形式存在，膜电位低进入线粒体的JC 1就少，并以发出绿色荧光的单体形式存在。由于容易受到胞浆内JC 1单体的影响，一般以细胞内红色荧光的强弱来反映线粒体膜电位的高低。本研究率先采用了JC 1染剂结合流式细胞仪的方法检测肝细胞线粒体膜电位的变化，发现该方法操作简单，结果稳定，可以作为肝细胞膜电位的常规检测方法。 NO是存在于多种组织内的生物活性介质，在脓毒症动物模型体内的许多脏器NO的产生都明显增多[12]，在某些情况下NO对肝脏具有一定的保护作用[13]，但NO的过度产生会使线粒体呼吸链酶复合物的功能受到抑制，阻碍线粒体氧化磷酸化过程，导致ATP合成减少、机体能量不足[2]。从脓毒症大鼠模型体内获得的肝细胞在促炎细胞因子(如IL 1β)的刺激下，iNOS的表达增强，NO合成增多，而线粒体ATP合成减少，这一结果提示NO可能通过线粒体途径参与了脓毒性炎症反应所介导的肝脏损伤[7]。本实验用IL 1β刺激体外培养的原代大鼠肝细胞，发现肝细胞产生NO明显增多，而肝细胞线粒体膜电位显著降低，两者均呈时间依赖性，在刺激后24 h作用强度最大，两者变化趋势具有明显的相关性(r=-1)，从而进一步验证了NO对线粒体功能的抑制作用。然而这种抑制作用从总体水平而言究竟对机体是有利还是有害目前还不明确，有人认为NO介导的线粒体功能障碍是MODS的重要致病机制，然而最近又有人提出NO对线粒体的抑制可以降低机体整体的代谢率，使各脏器处于一种“代谢休眠”状态，以适应机体能量不足的状态，有利于机体渡过疾病最严重的阶段[3]，这些假说是否成立还有待进一步的研究。 本实验引入LPS作为对照组之一，主要有两个原因:其一是为了观察LPS对肝细胞NO的产生是否具有直接刺激作用，因为LPS被认为是脓毒症最主要的致病原，结果发现，虽然LPS刺激后肝细胞NO合成略有增加，但与NS组比较无显著差异，说明LPS对大鼠原代肝细胞NO的合成没有直接促进作用;其二可以检验肝细 胞的纯度，如果获得的肝细胞受到枯否细胞的污染将会影响实验结果的可靠性，因为枯否细胞对LPS高度敏感，并能够通过LPS介导肝细胞的损伤[14]。本研究结果显示LPS对肝细胞线粒体膜电位的影响与NS没有显著差异，而LPS和IL 1β联合刺激对肝细胞NO的合成以及膜电位的降低也没有明显的协同作用，说明通过本实验方法获得的肝细胞具有较高的纯度。 当肝细胞被刺激48 h后，无论是NO的产生还是线粒体膜电位的降低，各组间的差异又趋于一致，这可能与培养液中营养物质耗竭代谢产物积聚引起的细胞活力下降有关。另外，本实验还发现细胞存活率与线粒体膜电位的变化并不一致，说明线粒体膜电位的降低并不意味着细胞死亡，这与Brealey等[6]的研究结果类似，他们发现脓毒症模型大鼠的肝脏线粒体功能被明显地抑制，但组织学上却没有肝细胞坏死的证据，说明两者间可能存在时间顺序，或者是从量变到质变的一个过程，如何明确其转变机制并加以调控可能对脓毒症的治疗具有潜在的价值。 虽然体外实验无法完全模拟体内的实际情况，但本实验为研究NO介导的线粒体功能障碍建立了一个良好的体外模型，即采用1 nmol?L-1浓度的IL 1β刺激体外培养的大鼠原代肝细胞24 h，可以有效地诱导肝细胞NO的合成和线粒体膜电位的降低，为下一步分子机制的研究打下基础。 【