人乳头瘤病毒LAMP检测方法实验研究

人乳头瘤病毒LAMP检测方法实验研究 罗永富 湖南中医药高等专科学校 湖南.株洲 412012 人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一群无包膜的DNA病毒，大约有100多个基因型，其中50%以上引起生殖器疣(GW)，90%的尖锐湿疣由 [1,2]6型和11型HPV引起有关研究报道HPV引起的尖锐湿疣与宫颈癌的发生有，[3]密切关系。 HPV由于其特有的发育方式而至今不能进行体外细胞培养，且其抗原接触免疫系统的机会少，难以用检测抗体的方法诊断。PCR、DNA探针检测病毒DNA序列具有特异及敏感等特点，但需要特殊的仪器设备，且对检测人员有较高的技术要求，难以用于基层。电镜直接检测病毒需要电子显微镜，使得这些方法难以在基层临床开展;环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果及反应时间短等优点。课题组对LAMP技术检测人乳头瘤病毒6型和11型的方法进行了实验研究。 1材料与方法 1.1 材料 10例标本均取自邵阳医专附属医院基因诊断室。其中6例经1.1.1 临床标本来源 荧光PCR验证的HPV病毒阳性临床标本;2例沙眼衣原体阳性标本和2例解脲支原体阳性标本作为LAMP检测HPV病毒的阴性对照。 限制性内切酶为Promega公司产品;Betaine为Fluka公司产品;Bst DNA 1.1.2试剂 Polymerase 为Biolabs 公司产品; 100bp DNA Ladder为BioDev公司产品;DNA Maker I为天根公司产品;dNTP为北京鼎国公司产品;一管式病毒DNA提取试剂盒为四川天泽公司产品;Taq plus DNA 聚合酶(北京鼎国公司);MgSO4为Sigama公司产品;其余试剂为国产分析纯。 1.1.3引物 选取HPV-6 E6 基因(登录号:AF092932)的174bp-381bp序列和HPV-11E6 基因(登录号:M14119)的129bp-306bp区域序列， PrimerExplorer V4 分别四条LAMP 引物(序列见1) ，引物由广州英骏公司合成。 表1(HPV-6和HPV-11 LAMP寡核苷酸引物序列 引物名称 寡核苷酸序列(5’-3’) F3-HPV-6 GCATACGTTGCAAATTAATTGTG (F3) B3-HPV-6 AGTTTCTTCTTCAACAGTTGTT (B3c) FIP-HPV-6 AGGACCTTTAGCTGTTTATATGCATTGTTTTGCAAGAATGCACTG (F1c-F2) BIP-HPV-6 GGCGGCTATCCATATGCAGCGCATAATCAAAGTGTCTATATTGGT (B1-B2c) F3-HPV-11 GCAACATCTATAGACCAGTTGT (F3) B3-HPV-11 CTAAGCAACAGGCACACG (B3c) FIP-HPV-11 CATTCCTGCAAAACACGCACGCAAGACGTTTAATCTTTCTTTG (F1c-F2) BIP-HPV-11 ACTGACCACCGCAGAGATATGAAAGTTGTCTCGCCACA (B1-B2c) 2 方法 2.1引物交叉反应可能性分析 将以上扩增HPV-6的4条引物及扩增HPV-11的4条引物分别与HPV-11及HPV-6的E6DNA序列进行互补分析，确定其发生交叉反应的可能性。 2.2 样本处理与模板DNA的制备 取病毒棉拭子标本，置1mL无菌生理盐水中，充分振荡悬浮，挤干棉拭子中的水分，弃棉拭子，15000rpm离心5min，弃上清液，留沉淀，加600μL病毒DNA提取液充分混匀，加700μL异丙醇，振荡混匀，12000rpm离心1min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2次，12000rpm离心1min，弃上清，将离心管倒置与滤纸上10,15min，待酒精挥发干净后加入100μL TE溶液放4?过夜充分溶解DNA，-20?保存备用。 2.3 HPV临床标本分型 分别用HPV-6和HPV-11LAMP引物检测6例阳性临床标本，引物为表1引物。 2.4 酶切鉴定 取HPV-6LAMP产物?和HPV-11LAMP产物?分别进行酶切分析，以位于HPV-6 E6基因251bp-254bp区域的AluI和以位于HPV-11E6基因156bp-159bp区域的TaiI作为酶切位点，AluI酶切反应体系为:LAMP产物:4 μL，ddHO:4 μL，10×bμffer R:1 μL，内切酶(10 Μ/μL):1 μL。轻弹混匀离后37?2 孵育16 h 完成酶切反应。TaiI 酶切反应体系同上，65 ?孵育16 h完成酶切反应。酶切后取2.5μL LAMP酶切产物及未酶切的产物进行电泳分析，方法同上述。 2.5 LAMP特异性分析 LAMP检测HPV-6的特异性观察:以HSV-1、HSV-2、HPV-11、沙眼衣原体、解脲支原体、空白为对照组。LAMP检测HPV-11的特异性观察:以HSV-1、HSV-2、HPV-6、沙眼衣原体、解脲支原体、空白作为对照组。 2.6 LAMP敏感性分析 260 nm测HPV DNA浓度，调整浓度为10 ng/µL，10倍 -1-2-3-4-5-6系列稀释为10×10、10×10、10×10、10×10、10×10和10×10 ng?µl 6个浓度，分别用LAMP和PCR检测。 2实 验 结 果 2.1引物交叉反应可能性分析 扩增HPV-6的4条引物与HPV-11E6DNA序列及扩增HPV-11的4条引物与HPV-6的E6DNA序列用BLAST软件进行互补分析:HPV-6引物不与HPV-11E6 DNA序列互补，HPV-11引物不与HPV-6E6 DNA序列互补。 2.2 临床标本分型检测结果 用HPV-6LAMP引物检测6例HPV-6/HPV-11阳性的临床标本，临床标本号为?，?，?，?，?的出现LAMP条带，认为与HPV-6感染有关(图1-A);用HPV-11LAMP引物检测6例HPV-6/HPV-11阳性的临床标本，结果发现?，?，?，?出现LAMP条带，认为与HPV-11感染有关(图1-B)。 图1-A 图1-B 图 1- A :HPV-6 LAMP 引物扩增HPV6/11阳性临床标本的特异性:1:100bp DNA分子量 ;2,8:HPV6/11阳性临床标本?，?，?，?，?，?，空白对照。 图 1 - B :HPV-11 LAMP 引物扩增HPV6/11阳性临床标本的特异性:1:100bp DNA分子量标准;2,8:HPV6/11阳性临床标本?，?，?，?，?，?，空白对照。 2.3 HPV LAMP的酶切结果 取HPV-6LAMP产物?和HPV-11LAMP产物?分别进行酶切分析，AluI酶切片段有:139bp;70bp;118bp;11 bp(见图2-A)。TaiI酶切片段有:196bp;160bp;144bp;144 bp;25 bp(见图2-B)。结果与理论预计相符。 图2-A 图2-B 图 2-A HPV-6 LAMP产物酶切图 1:DNA 分子量标准;2:HPV-6未酶切 LAMP产物;3:AluI酶切后LAMP产物(酶切片段主要有:139 bp;70bp;次要片段有:118bp;11bp)。图 2 -B HPV-11 LAMP产物酶切图 1: DNA 分子量标准;2:HPV-11未酶切 LAMP产物;3:TaiI酶切后LAMP产物(酶切片段主要有:196 bp;160bp;144bp;次要片段有:144bp;25bp)。 2.4LAMP特异性分析 LAMP检测结果显示:HPV-6 DNA和HPV-11DNA出现特征性梯状条带，而全部对照组DNA未扩出条带(见图3-A，图3-B)。 图3-A 图3-B 图 3-A LAMP 扩增HPV-6的特异性 1:DNA分子量标准;2,8:HPV-6，HPV-11，HSV-1，HSV-2，解脲支原体，沙眼衣原体，阴性对照。 图 3 -B LAMP 扩增HPV-11的特异性 1:DNA分子量标准;2,8:HPV-11，HPV-6，HSV-1，HSV-2，解脲支原体，沙眼衣原体，阴性对照。 2.5 LAMP敏感性分析 LAMP和PCR检测HPV-6、HPV-11的敏感性均为1 pg/µL(见图4-A、图4-B)。 图4-A 图4-B -1-6图 4 –A:LAMP 检测HPV-6的敏感性 1,6:10×10,10×10 HPV-6 DNA ng/µl;7:100 bp DNA分子量标准。图 4-B LAMP 检测HPV-11的敏感性 1:100 bp DNA分子量标 -1-6 准;2,7:10×10,10×10 HPV-11 DNA ng/µl。 3讨 论 3.1低危型HPV-6和11常感染外生殖器和肛周引起尖锐湿疣，近年来，尖锐湿疣的发病率越来越高，在欧美国家已居性传播疾病的首位，在我国居第二位，以成为 [4]人们关注的社会公共问题之一。此外，高危型HPV常与宫颈癌的发生密切相关，因此，HPV DNA的检测和分型对流行病学的调查和公共健康问题具有重要的价值。由于缺乏体外培养系统和可靠的血清反应物，所以HPV的检测几乎完全依赖于用分子生物学方法检测其基因, 如PCR法, 然而这些方法比较费时且需要特殊 [5][6]的仪器，因此在临床推广应用上受到限制。自Notomi 等发明LAMP技术以来， [7] [8] [9]以用于检测各种类型的传染性病原体，主要包括EB病毒、HIV、水痘-带状 [10][11][12][13][14]疱疹病毒、SARS冠状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、单 [15]纯疱疹病毒等，证明了LAMP技术是一种快速、敏感、特异、简便的检测方法，可用于传染性疾病的快速诊断。 3.2本研究建立了检测HPV特异的LAMP方法，将扩增HPV-6的4条引物及扩增HPV-11的4条引物分别与HPV-11及HPV-6的E6DNA序列进行互补分析，结果为:HPV-6引物不与HPV-11E6 DNA序列互补，HPV-11引物不与HPV-6E6 DNA序列互补，理论上提示HPV-6和HPV-11引物具有较高的型特异性。我们收集了6例经荧光PCR鉴定过的HPV临床标本，首先用HPV-6和HPV-11引物对6例HPV临床标本进行分型，检测发现该6例HPV标本中可检测出标本号为?，?为仅HPV6阳性，?为仅HPV-11阳性，此外?，?，?号临床标本用HPV-6和HPV-11引物都能出，显示此临床标本存在HPV-6和HPV-11两型病毒同时感染。取HPV-6LAMP产物?和HPV-11 LAMP产物?分别进行酶切鉴定，酶切电泳结果与理论值相符，进一步证实我们设计的引物具有型特异性，无交叉反应。特异性实验结果显示我们建立的HPV LAMP检测方法具有特异性，不与沙眼衣原体、解脲支原体等发生交叉反应。敏感性实验结果显示LAMP检测人乳头瘤病毒6型、人乳头瘤病毒11型DNA -6的最低浓度可达10×10 ng /µl水平，其敏感性与PCR相当。以上结果显示该法不仅可区别HPV-6型和11型感染，且具有较高的特异性与敏感性，有望用于HPV-6和HPV-11 型的快速检测。 参考文献 [1] En FX, Wei X, Jian L,te al. 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[15]彭丁晋，罗永富，周支香.环介导等温扩增技术检测单纯疱疹病毒?型的应用 [J].中国病原生物学杂志.2011.6(2):101-103 [2011年度湖南省普通高校科学研究课题，编号:11C0975] 作者简介:罗永富 男 1957.8 湖南华容 生物化学副教授 本科 医学学士 生物化学 教学与研究。工作单位:湖南中医药高等专科学校 地址:湖南株洲市高家坳湖南中医药高等专科学校 邮编:412012 电话: E-mail:lyf155@263.net 人乳头瘤病毒LAMP快速的检测方法实验研究 罗永富 湖南中医药高等专科学校 湖南.株洲 412012 中文摘要 目的: 建立人乳头瘤病毒的环介导等温扩增技术检测方法。方法: 设计扩增各 型病毒特异基因的LAMP引物，提取病毒DNA，配置LAMP反应体系，60,65 ? 保温约60 min，完成对靶病原体基因的扩增，肉眼及电泳判定扩增结果。LAMP 扩增产物经酶切进一步鉴定;设立对照组，评价LAMP方法的特异性;10倍系 列稀释模板，检测LAMP技术的敏感性。结果: 实验组经LAMP后，肉眼观察 到LAMP扩增产物的出现，电泳后呈LAMP特征性梯状条带，对照组均无扩增 产物;HPV的 LAMP扩增产物经相应限制性内切酶酶切鉴定正确，特异性实验 结果显示与对照组无交叉反应，具有特异性;LAMP可检测到单纯疱疹病毒1 型、单纯疱疹病毒2型DNA的最低浓度分别是1 pg/µL、10 pg/µL L，其敏感性 与PCR相当。结论: 环介导等温扩增技术检测HPV-6和11型，具有特异、敏 感、快速、仪器设备要求低、结果便于观察、适合于基层医疗单位推广等优点， 可作为临床检测方法推广应用。 关键词: 环介导等温扩增，人乳头瘤病毒，检测方法,研究 Research on Detection Method of Human Papillomavirus with Loop-mediated Isothermal Amplification Luo Yongfu (Hunan Traditional Chinese Medical College Zhuzhou Hunan 412012) [Abstract] Objective: To establish the detection method of human papillomavirus (HPV) Type 6 and Type 11 with Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) .Methods: We designed the LAMP primers of various virus-specific genes and extracted the viral DNA,which was insulated in 60 to 65 celsius for approximately 60 minutes . With configured LAMP reaction system we completed the amplification of DNA of target pathogens and judged the results with naked eyes and electrophoretic analysis. The products of LAMP were more confirmed by digestion. Setting up the control group, we evaluated the specificity of LAMP assay through the control of pathogens and test for the sensitivity of LAMP technology with 10-fold serially diluted template.Results: After LAMP reaction, the amplification products of LAMP and marked ladder patterns to the LAMP assay were observed with naked eyes and electrophoretic analysis for experimental pathogens while no products were found for control ones. The products of HSV with LAMP were confirmed properly by digestion of corresponding restriction endonuclease. The specificity result showed that there was no cross reaction between the two pathogens. The minimum concentration detected by LAMP assay for DNA of HPV-6 and DNA of HPV-11 was 1 pg/uL and 10 pg/uL respectively and the sensitivity with LAMP assay was equal to the one with PCR assay.Conclusions: The detection of HPV-6 and HPV-11 with LAMP assay has the advantages of specificity, sensitivity, rapidness and it is easy to be observed the result and can be applied to the clinical detection. Key words: LAMP, HPV, detection method, research