c-myc、mdm2及p53基因在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达

c-myc、mdm2及p53基因在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的达 c-myc、MDM2及P53基因在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达 及临床意义 中文摘要 目的:原癌基因c-myc、MDM2和抑癌基因P53与原发性腹膜后脂肪肉瘤 (PRL)的关系研究较少，本文拟探讨原发性腹膜后脂肪肉瘤中c-myc、MDM2及 P53基因蛋白表达及三者与肿瘤发生、发展的关系。方法:应用免疫组化PV— 6000两步法对原发性腹膜后脂肪肉瘤(48例)及脂肪瘤(15例)组织中c-myc、 MDM2及P53基因蛋白的表达进行检测，利用统计学软件对其与患者性别、年 龄、肿瘤大小及病理分化程度等指标进行统计学。结果:c-myc、MDM2及 P53蛋白在原发性腹膜后脂肪肉瘤中表达阳性率分别为58.33%(28?48)，64.58% (31?48)，50%(24?48)，三种蛋白在脂肪肉瘤与脂肪瘤组织中的阳性率差异 有显著性(P〈0.05)。三种蛋白均与患者的性别、年龄及肿瘤大小无相关性。不 同类型脂肪肉瘤分化较好者阳性率明显低于分化较差者。原发性腹膜后脂肪肉瘤 中c-myc、MDM2及P53蛋白之间的表达两两呈正相关(P〈0.05)，c-myc、MDM2 及P53蛋白表达在原发者与复发者之间的差异均无统计学意义(P〉0.05)。结论: c-myc、MDM2及P53蛋白与原发性腹膜后脂肪肉瘤的形成、分化及恶性程度有 关，它们可作为判断原发性腹膜后脂肪肉瘤分化程度及恶性程度参考指标之一， 但与肿瘤复发无关。在脂肪肉瘤的发生、发展中三者可能起协同作用。 关键词:腹膜后; 脂肪肉瘤; c-myc; MDM2; P53Expression and Clinical Significance of c-myc, MDM2 and P53 in Primary Retroperitoneal Liposarcoma Abstract Objective: The relationship between primary retroperitoneal liposarcoma(PRL) and gene c-myc, MDM2 and P53 is not clear. This study discusses primary retroperitoneal liposarcoma of the c-myc, MDM2 and P53 gene protein expression and relationship with tumor occurrence and development. Methods: Application of two-step immunohistochemical PV - 6000 of primary retroperitoneal liposarcoma(48 cases)and lipoma(15 cases) tissue c-myc, MDM2 and P53 gene protein expression were detected in the organization, Use of statistical software for it with patient's sex, age, tumor size and degree of pathological differentiation index for statistical analysis. Results: Conclusion: The c-myc, MDM2 and P53 protein are associated with the development, differentiation, and malignancy of liposarcoma, but not with the recurrence of liposarcoma. Detecting the level of c-myc, MDM2 and P53 protein expression may be valuable in evaluating the level of differentiation and malignancy of liposarcoma.Key Words:Retroperitoneal; liposarcoma; c-myc; MDM2; P53 c-myc、MDM2及P53基因在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达 及临床意义引言 原发性腹膜后脂肪肉瘤(primary retroperitoneal liposarcoma，PRL)是一种临床上较少见的恶性肿瘤，在人体所有恶性肿瘤中其发病率所占比率不足[1]1%，而在原发性腹膜后软组织肿瘤中原发性腹膜后脂肪肉瘤却是最多见的一种类型，常见于腹膜后及肾脏周围，另外可来源于盆腔及肾上腺等部位。该病患者男性略多于女性，多于40~60岁之间发病。由于早期症状不明显，大部分肿瘤被发现时已经巨大且与周围组织关系密切，完整切除困难，这也成为了腹膜后脂肪 [2]肉瘤切除后再次发病的常见原因。既往有文献报道，黏液性及高分化脂肪肉瘤 [2]的5年生存率超过70%，而多形性及圆形细胞型脂肪肉瘤5年生存率约为18%，5 [3]年复发率大约为28%，而10年复发率则约为48%。由于初期诊断原发性腹膜后肿瘤较为困难，其治疗的效果不明显，且该病复发率高以及较少发生转移，因此在临床上为手术治疗提供了机会，是应该仔细研究的一类肿瘤。 依据世界卫生组织遗传学，病理学分类以及软组织肿瘤(2002年)的相关记录，脂肪肉瘤可以分为黏液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma, MLS)、高分化脂肪肉瘤(well difierentiated liposarcoma, WD)、去分化脂肪肉瘤(dedifferentiated liposarcoma, DDLS)、圆形细胞型脂肪肉瘤(round-celled liposarcoma, RCLS)及多形性脂肪肉瘤(pleomorphic liposarcoma, PLS)。高分化型脂肪肉瘤为上述类型中最多见的类型，又被称之为分化较好的脂肪肉瘤，又可分为硬化性脂肪肉瘤(SLS)以及脂肪瘤样脂肪肉瘤(LLS)2个亚型。 [4]既往有学者研究高分化型脂肪肉瘤在全部脂肪肉瘤中所占比例约为54%，本组病例中高分化脂肪肉瘤仅占18.75%(9/48)。此外，本组病例含有黏液性24例，7例为多形性，6例为去分化型，2例为圆形细胞型。 原发性腹膜后脂肪肉瘤的发生、发展可能是多种基因突变累积的结果，在原发性腹膜后脂肪肉瘤的发生及发展过程中存在着互相协调的共同表达的基因群。对原发性腹膜后脂肪肉瘤从基因水平上进行探索,挑选出与此肿瘤有关的在多个节点上发挥功能的分子以及可能起到重要调控作用的有关基因,对揭示原发性腹膜后脂肪肉瘤在基因水平的改变及阐明原发性腹膜后脂肪肉瘤发生的分子机制及其本质，了解原发性腹膜后脂肪肉瘤发生、发展的规律，并有效地控制及治疗原发性腹膜后脂肪肉瘤有着非常重要的作用。 c-myc是myc基因族系中最主要的成员之一，是原癌基因中较常见的一种，其 [5]在人类约20%的肿瘤中处于活化形态。c-myc蛋白作为它的翻译产物非正常表达 [6]于许多人类癌肿内，这对细胞周期的转变、基因不确定性、细胞的凋亡及恶性 [7,8]转化起着特殊的调控作用。目前c-myc与上皮源性肿瘤的关系研究较多，与PRL 的关系研究较少，本文旨在通过检测c-myc基因蛋白在PRL中的表达，进一步研究两者之间的关系，以期探讨其与PRL发生、发展的关系。 [9] MDM2基因是Cahily-Snyder等在1987年第一次由一个自发转变的拥有双微体(DM)的BALB/3T3细胞内克隆出来的，该基因具有较高扩增性。后来，Fakharzadeh等也克隆了该因子，发现细胞的癌变与其快速扩增关系密切。Oliner[10]等于1992年在人染色体12q13-14内克隆出mdm2基因。MDM2基因广泛表达于人类的许多肿瘤中，并且其表达程度常常与肿瘤的病理、临床分型及是否转移关系密切。有关MDM2在肺癌、消化道肿瘤及泌尿系统肿瘤等上皮源性肿瘤的研究较多，在间叶源性的肿瘤如PRL中的表达研究较少。本文旨在通过检测MDM2在PRL中的表达，探讨MDM2对PRL的发生、发展的影响。 P53基因是已被探明的与人体肿瘤的发生及肿瘤的发展联系相当密切的一个肿瘤抑制基因，它最主要的生物学特征是通过调控细胞周期、DNA的损伤修复以及诱导细胞的凋亡，来维护细胞与基因组的稳定，从而达到抑制肿瘤生长的目的。人类P53基因处于染色体17q13上，其含有10个内显子及11个外显子。野生型P53具有通过一系列信号转导作用来抑制肿瘤生长的生物学特性，是一种抑癌基因;而突变型P53基因对肿瘤的产生、进展则起到促进作用，是一种原癌基因，但其具体机制当前尚不明确。本文旨在通过检测突变型P53基因蛋白在PRL中的表达，进一步研究两者之间的关系，以期探讨其与PRL发生、发展的关系。 目前有研究表明c-myc、MDM2及P53基因的表达与原发性腹膜后脂肪肉瘤的发生、发展有一定关系，但是原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中c-myc、MDM2及P53基因的表达及其临床意义仍然有待于进一步研究。 本实验是应用免疫组化PV-6000二步法，检测并比较c-myc、MDM2及P53基因在48例原发性腹膜后脂肪肉瘤组织以及15例脂肪瘤组织的石蜡块中表达情况，分析c-myc、MDM2及P53蛋白与原发性腹膜后脂肪肉瘤临床特征间的相关性，探讨其在原发性腹膜后脂肪肉瘤发生、发展及诊断中的意义。 第一章 材料和方法 1.1 标本的收集 收集2000年12月至2012年12月青岛大学医学院附属医院在手术中切除的原发性腹膜后脂肪肉瘤和脂肪瘤病例，患者均有完整的临床病理资料。原发性腹膜后脂肪肉瘤标本48例，其中原发病例23例，复发病例25例;男性病例29例，最大年龄78岁，最小年龄39岁，平均年龄57.76岁，中位年龄59岁;女性病例19例， 最大年龄75岁，最小年龄34岁，平均年龄56.11岁，中位年龄57岁。其中?60岁者，31例，,60岁者，17例。肿瘤直径2~40cm，平均18.31cm，?20cm 28例，,20cm 20例。组织学分级参照世界卫生组织肿瘤病理学，遗传学以及软组织肿瘤(2002年)的有关描述为，组织学分级:高分化脂肪肉瘤9例，黏液性脂肪肉瘤24例，多形性脂肪肉瘤7例，去分化脂肪肉瘤6例，圆形细胞型脂肪肉瘤2例。脂肪瘤病例15例作为对照。所取的组织均用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。 1.2 主要仪器和试剂 1、主要仪器: 磨刀器 Mdj-48 天津天利航空机电公司 切片机 LEICA RM(2135)型 德国 LEICA 有限责任公司 飘烘处理仪 zmn-6802型 江苏常州华立电子有限公司 隔水式电热恒温干燥箱 山东省潍坊医疗器械厂 电热恒温水浴箱 Wsz-134-75 山东省潍坊市医疗器械制造厂 海尔 微波炉 85Dw 山东省青岛市Hair公司 组织微式矩阵仪 德国Beecher有限公司 彩色监控闭路摄像机 Wv-Cp430/Ch 日本Panasonic有限公司 普通冰箱 山东青岛海尔公司 光学显微镜 2、主要试剂: 兔抗人 c-myc 单克隆抗体 (从北京市，中山金桥生物技术有限公司，购买) 单克隆抗体 (从北京市，中山金桥生物技术有限公司，购买) 鼠抗人 MDM2 鼠抗人 p53 单克隆抗体 (从北京市，中山金桥生物技术有限公司，购买) 浓缩型 DAB 试剂盒 (从北京市，中山金桥生物技术有限公司，购买) PV-6000 试剂盒 (从北京市，中杉金桥生物技术有限公司，购买) PBS液 (青岛大学附属医院病理科配置) 抗原修复液 (青岛大学附属医院病理科提供) 1.3 免疫组化实验过程 PV-6000 二步法具体实验步骤: 1、石蜡切片的脱蜡及水化: (1)切片脱蜡，将其浸没于二甲苯?溶液中约15min;(2) 浸泡于二甲苯?溶液中15min;(3)将切片依次浸泡于梯度酒精溶液中:100%酒精内2min?95,的酒精内1min?85,酒精内1min?75,酒精内1min;(4)用蒸馏水冲洗3次。且每次将切片放入蒸馏水中清洗约2min。 2、抗原修复(高压热修复,微波法): 按照将使用一抗的特点，对实验切片进行必要预处理，采用热抗原法修复:配置抗原修复液枸橼酸钠，稳定它的pH值在8.0，将其倒入玻片缸内。将切片置于缸内，确保修复液浸没切片，然后放入微波炉，进入抗原修复过程，火位 100持续约2分钟? 火位 30持续约7分钟，共需3次，自然冷却， 放进PBS溶液中浸泡约2分钟，共需4次;修复过程如出现修复液量不足，应给与适当添加。 3、过氧化物酶的活性阻断:在室温下将切片置于3,H2O2的去离子水内孵育约5分钟，来阻断可能的内源性的过氧化物酶，然后放于PBS液中反复清洗3次。 4、孵育一抗: 去除PBS溶液，将一抗逐一添加至所有切片中(一抗浓度由预实验得出，且使用的稀释浓度为1:100)，让其涵盖所有组织，培育约60分钟在温室下，然后以PBS溶液反复洗涤3次，每次持续2分钟。 5、加PV-6000工作液: 去除PBS溶液，向每张切片中加入PV-6000工作液(通用型多聚体IgG抗体-Hrp)，并淹没全部组织，在室温下培育约15分钟，用PBS溶反复洗涤3次，每次约2分钟。 6、显色: 将PBS冲洗液去除，把1滴新配的DAB液滴至所有玻片，待显色完全后，在显微镜下查看，时间约3至10分钟，连续用蒸馏水洗涤，以促进反应终止。 DAB液制备:将1滴(约50 ul)试剂A加入1毫升双蒸馏水中，使之均匀混合，然后分别向上述溶液中各分别入1滴试剂B及试剂C，使之充分混合，制作完成后避光保存，有效期为30分钟。 7、苏木素的复染: 用苏木素溶液复染时需蒸馏水反复洗涤，时间约3-5分钟;接着于酒精的盐酸溶液中(插提1-2次)浸泡约15s行分化过程，然后用蒸馏水反复冲洗;后放入0.5%氨水返蓝(插提1-2次)中，蒸馏水反复冲洗;最后，取出干燥。 8、脱水、透明、封片: 将切片放入不同浓度梯度酒精(85,酒精?95,酒精I ?95,酒精??100,酒精)中使之脱水干燥，再依次放进二甲苯I及二甲苯溶液?中透明处理，分别经过约10min，最后使用中性的树胶加以封固。 1.4 免疫组化对照的设立 阳性对照:用已知的原发性腹膜后脂肪肉瘤阳性切片作为阳性对照，结果显示阳性。 阴性对照:用 PBS液孵育原发性腹膜后脂肪肉瘤为阳性的切片作为阴性的对照，而不用一抗，结果显示阴性。 1.5 结果的判断 (1)用400倍光学显微镜观察，有明显的棕黄色颗粒出现的细胞为阳性细胞。c-myc蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞核，部分也表达于胞浆，呈粗细不等、深浅不一的棕黄色颗粒。P53及MDM2蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞的细胞核，亦呈粗细不等、深浅不一的棕黄色颗粒。每张切片任意选10个高倍的视野观看，按照肿瘤细胞染色强度分为4个等级即:无色，0分;浅黄色，棕黄色，棕褐色，分别记1,2，3分。依照阳性细胞在肿瘤细胞中百分比分为5个等级即:0，1~25%，26~50%，51~75%，,75%，分别记0,1,2,3，4分;着色强度和阳性表达的细胞数目评分之和为最终积分，判断标准为:(-)0分，(+)2,3分，(++)4,5分，(+++)6,7分，其中(+)、(++)和(+++)判定为阳性。(2)结果判断用双盲法，即每一张切片分别请2位病理科医生计数，如计数结果出入10%以上则从新计数。运用半定量积分分级的方法来判定结果。注:最终分数为阳性表达细胞和着色强度两项得分之和，判断标准为:(-)0分，(+)2,3分，(++)4,5分，(+++)6,7分，其中以(+)、(++)和(+++)的结果判定为阳性。 1.6 统计学处理 2x本实验定性数据的描述应用?s，定量的数据描述采用构成比，采用χ检 验来描述组间的比较，相关性分析采用Spearman 等级相关分析。检验水准为α=0.05，取双侧，结果判定则以P,O.05有统计学意义。统计软件采用SPSS l8.0。 第二章 结果 2.1 c-myc、MDM2及P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤及脂肪瘤组织中的表达 c-myc蛋白阳性表达多位于肿瘤细胞的细胞核和胞浆，在对照组15例脂肪瘤组织中仅有1例出现了弱阳性(图1.3)，而原发性腹膜后脂肪肉瘤组织48例中28例出现阳性表达(图1.1,1.2)，阳性表达率为:58.33%。在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中c-myc的表达明显高于在组织脂肪瘤中的表达，差别在统计学上有 2意义(P<0.05，χ=10.519)。MDM2蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞核内，对照组15例脂肪瘤组织中仅有3例出现了阳性表达阳性表达率为:20.00%;而原发性腹膜后脂肪肉瘤组织48例中31例出现阳性表达，阳性表达率为:64.58%。MDM2在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中的表达高于在脂肪瘤组织中的表达，差异有统 2计学意义(P<0.05，χ=9.144)。 P53蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞核，对照组15例脂肪瘤组织中仅有1例出现弱阳性表达，阳性表达率为:6.70%;而原发性腹膜后脂肪肉瘤组织48例中24例出现阳性表达，阳性表达率为:50.00%。P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中的表达要高于其在脂肪瘤组织中的表达，这种差异具有统计学意义2(P<0.05，χ=8.966)。 2.2 c-myc、MDM2及P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达 c-myc的阳性颗粒多位于肿瘤细胞核内，少数细胞核及胞浆内均有阳性颗粒。分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括黏液性和高分化)c-myc阳性率42.42%(14/33)，要低于原发性腹膜后脂肪肉瘤分化较差的类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化)c-myc的阳性率93.33%(14/15)，两者间差异在统计 2学上有意义(χ=10.996，P=0.001<0.05)。 MDM2的阳性颗粒见于肿瘤细胞的细胞核内，分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括黏液性和高分化)MDM2阳性率51.52%(17/33)，要低于原发性腹膜后脂肪肉瘤分化较差的类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化)MDM22阳性率93.33%(14/15),两者的差异在统计学上有意义(χ=7.884，P=0.005<0.05)。 P53的阳性颗粒位于肿瘤细胞核内，分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括高分化和黏液性)P53阳性率33.33%(11/33)，要低于原发性腹膜后脂肪肉瘤中分化较差的类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化)P53阳性率86.67%2(13/15),两者间的差异在有统计学上有意义(χ=11.733，P=0.001<0.05)。 2.3 c-myc、MDM2及P53在原发及复发腹膜后脂肪肉瘤中的表达 在此48例原发性腹膜脂肪肉瘤中，原发者23例，c-myc在原发病例中的表达阳性率为:60.87%(14/23);复发者25例，c-myc在复发者中表达阳性率为: 256.00%(14/25)。经统计学处理，两者差异在统计学上无明显意义(χ=0.117，P=0.732>0.05)。 在本组实验中，原发性腹膜后脂肪肉瘤病例48例，其中原发23例，MDM2在原发病例中的阳性表达率为:56.52%(13/23);复发者25例，MDM2在复发者中表达阳性率为:72.00%(18/25)。经统计学处理，两者差异在统计学上无明2显意义(χ=1.255，P=0.263>0.05)。 在本组实验中，原发性腹膜后脂肪肉瘤病例48例，其中原发23例，P53在原发病例中的阳性表达率为:39.13%(9/23);复发者25例，MDM2在复发者中表达阳性率为:60.00%(15/25)。经过统计学分析，两者间差别无明显统计学 2意义(χ=2.087，P=0.149>0.05)。 2.4 c-myc、MDM2及P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达与其临床特征的 关系 c-myc、MDM2及P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达，在年龄组 (P =0.202)、性别 (P =0.517)及肿瘤大小(P =0.692)方面，其阳性的表达率均无明显统计学差异，结果无统计学意义(P >0.05)。 2.5 原发性腹膜后脂肪肉瘤中c-myc、MDM2及P53表达的相关性 本组数据应用Spearman相关分析，分析c-myc、MDM2及P53基因蛋白在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中表达的相互关系，分析结果为:c-myc与MDM2在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中的表达呈正关(r=0.434，P=0.002<0.05);c-myc在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中的表达与P53的表达呈正关(r=0.338，=0.019<0.05);MDM2与P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中的表达呈正关P (r=0.305，P=0.035<0.05) 第三章 讨 论 [11][12]脂肪肉瘤来源于支持组织，大多数为原发性肉瘤，多见于大腿和腹膜后，[13]有少数发生在盆底，发生在肝脏的也有报道。原发性腹膜后脂肪肉瘤(primary retroperitoneal liposarcoma，PRL)是一种少见的恶性肿瘤，在人体全部恶性[1]肿瘤中其发病率所占比例不足1%，然而在原发性腹膜后软组织肿瘤中脂肪肉瘤是最多见的类型，其多发生于腹膜后、肾脏周围，另外也可来源于肾上腺及盆腔内组织。在原发性腹膜后肿瘤中，原发性腹膜后脂肪肉瘤局部复发率最高，预后[14,15]最差。脂肪肉瘤多好发于40岁以上成人，本组患者发病平均年龄56.94岁，中位年龄57岁。发病患者中男性常略多于女性，较少发生于青少年，本组患者[16]中男性患者占60.4,，此与既往的54,,61,基本相符。原发性腹膜后脂肪肉瘤的预后与手术程度、病理分级及肿瘤部位有关。手术完整切除者，术后[14,17-21][22]局部复发率低，生存率较高。Hiller报道手术完整切除患者5年生存率[23]为75%，而手术不全切除(R1/R2)者5年生存率约为34%。Shibata报道不全切除患者比不做手术切除患者能延长生存期，中位生存由4个月延长至26个月，并能缓解患者症状。该肿瘤常有如下几个显著特点:1)发生转移较其他恶性肿瘤晚。2)生存期相对较长，本组病例5年生存率在50%以上。3)由于发生部位[24]多比较隐匿，发现肿物时通常体积都比较大。4)腹膜后脂肪肉瘤多数都有伪[25]包膜，是因为肿物生长迅速压迫周围正常组织而出现的，一般认为这种伪包膜内常会有恶性细胞残留，是肿瘤复发的基础。 3.1 c-myc与原发性腹膜后脂肪肉瘤 c-myc作为myc基因族系中主要的一员，其已被既往实验证明是一种可移位基因，且稳定性受到多种要素调控，同时它也被证明是一种可以促进细胞进行无 限分裂，使其获得无限增值能力的基因。许多癌肿的产生及进展与c-myc基因干预细胞的凋亡过程关系密切。既往研究表明，其在20%的人类肿瘤中处在活化状[5][6]态。现已证实它的基因产物c-myc蛋白反常表达于多种癌肿内，其对基因不确定性、细胞周期的改变及新陈代谢、细胞的恶变及凋亡中发挥重要调节作用[7,8]。c-myc蛋白作为一种调节转录的蛋白，其作用的发挥是通过阻止或加强目的基因的转录过程实现的。c-myc基因的抑制表达基因包括p15、gas1、p27、p21[26,27]等特异性生长抑制基因，经过基因抑制作用可除去这些基因对细胞生长的抑制作用，进而对细胞的增殖及恶变过程起促进作用。 虽然对c-myc基因确切功能的了解尚未完全明确，但已有研究证实c-myc蛋白作为一种转录因子，当其调控失常过度表达时，其将会独自或与其他因素共同导致细胞发生恶性转变。本实验对原发性腹膜后脂肪肉瘤蛋白表达进行检测，结果显示，对照组脂肪瘤中c-myc基因几乎不表达，阳性率仅为6.7%(1/15)，而原发性腹膜后脂肪肉瘤阳性率则为58.33%(28/48)。两者间差异存在统计学意义(P<0.05)，提示c-myc基因表达异常与原发性腹膜后脂肪肉瘤的形成关系密切。实验结果还显示:分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括黏液性和高分化)c-myc阳性率42.42%(14/33)，要显著低于原发性腹膜后脂肪肉瘤分化较差的类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化)中c-myc阳性率93.33%(14/15),两者差别明显在统计学上有意义(P<0.05)。提示c-myc基因异常表达可能会与原发性腹膜后脂肪肉瘤的分化及恶性程度关系密切。在本实验48例原发性腹膜后脂肪肉瘤中，c-myc蛋白在原发病例与复发病例中的表达差异在统计学上无明显意义(P>0.05)，说明c-myc蛋白与肿瘤的复发可能无关。原发性腹膜后脂肪肉瘤中c-myc基因异常表达的分子生物学机制，尚有待于进一步研究。 3.2 MDM2与原发性腹膜后脂肪肉瘤 [9]Snyder等MDM2基因是Cahily-在1987年第一次从一个自发转变的拥有双薇体(DM)的BALB/3T3细胞内克隆出来的，该基因具有高度的扩增性。Fakharzadeh 等后来也克隆出此基因，而且发现细胞的致瘤性与其高度增殖性关[10]系密切。后来Oliner 等于人类染色体12q13-14上克隆出该基因。以往研究[28]表明MDM2与P53关系密切，MDM2与P53可组成自动调节反馈环路，二者形成复合物，从而P53介导的反式激活及诱使凋亡的功能被MDM2阻滞，最终导致肿瘤的发生。在人体多数肿瘤中，如一些乳腺肿瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤及恶性胶质中，都存在MDM2基因的扩增及其蛋白产物的异常表达。 本实验对原发性腹膜后脂肪肉瘤及脂肪瘤中MDM2基因蛋白表达进行检测，结果显示，对照组脂肪瘤中MDM2基因表达较低，阳性率仅为20.00%(3/15)，而原发性腹膜后脂肪肉瘤阳性率则为64.58%(31/48)。两者差异有统计学意义(P<0.05)，提示MDM2基因异常表达与原发性腹膜后脂肪肉瘤的形成有关。分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括高分化和黏液性)MDM2阳性率51.52%(17/33)，低于分化相对较差原发性腹膜后脂肪肉瘤(包括多形性、圆形细胞型及去分化)MDM2阳性率93.33%(14/15),其差别在统计学上有意义(P<0.05)。表明MDM2蛋白的异常表达可能与原发性腹膜后脂肪肉瘤分化及其恶性程度相关。在本组实验中，MDM2蛋白在原发与复发病例中的表达无明显统计学意义(P>0.05)，说明MDM2蛋白可能与原发性腹膜后脂肪肉瘤的复发无关。原发性腹膜后脂肪肉瘤中MDM2基因异常表达的分子生物学机制，尚有待于进一步研究。 3.3 P53与原发性腹膜后脂肪肉瘤 P53基因作为到目前为止与人体肿瘤最具关联性的基因之一，多年来，人们 对它的了解经过了三个不同的转化过程，即从癌蛋白的抗原，到癌基因，最后是肿瘤抑制基因，其抑制肿瘤生长的功能是通过调控DNA的损伤修补、细胞代谢及诱使细胞凋零，维护细胞和基因结构的稳定来实现的。研究发现人类的P53基因定位于染色体17q13上，其含有10个内显子和11个外显子。现在我们意识到，导致癌肿发生或是细胞变异的P53蛋白是由P53基因发生突变的结果，其是一种诱导肿瘤发生的蛋白，可以阻断P53的正常活性。野生型P53基因作为一种肿瘤抑制基因，其活性的丧失促进了肿瘤的发生，野生型P53基因的生物学功能主要是通过一系列信号转导来阻止肿瘤的发生;而突变型P53基因则作为原癌基因，对肿瘤的产生及进展起诱导作用，但其具体机制目前不明。 P53蛋白在软组织肿瘤中的表达，尤其是脂肪肉瘤的表达，国外文献报道不[29]一。Taubert在32例脂肪肉瘤中的报告，提示43%脂肪肉瘤中P53反常表达，[30]P53蛋白阳性与肿瘤分级关系不明显，与患者预后关系密切。但Kawai等脂肪肉瘤阳性率的报道约为13.6%。本组实验中P53蛋白的阳性率为50.00%，与[29]Taubert报道的相近，而在对照组脂肪瘤中阳性率仅为6.70%，差异在统计学上有意义(P<0.05)，提示P53基因表达异常可能与PRL的形成有关。分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括黏液性和高分化)P53阳性率33.33%(11/33)，远低于分化较差腹膜后脂肪肉瘤类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化型)P53阳性率86.67%(13/15),两者差别存在统计学意义(P<0.05)。提示P53基因异常表达可能与PRL的分化及恶性程度有关。另外本组实验还显示， .05)，说明P53P53蛋白在原发病例与复发病例中的表达无明显统计学意义(P>0蛋白与PRL的复发可能无关。另外其他蛋白(如热休克蛋白70等)于P53蛋白结合，可使P53蛋白的稳固性加强、半衰期增长，免疫组织化学出现阳性结果。因此PRL中其它因素对P53蛋白异常表达的影响尚不能排除，有待于进一步研究。 3.4 原发性腹膜后脂肪肉瘤中c-myc、MDM2及P53的关系 本实验研究结果表明，在原发性腹膜后脂肪肉瘤中c-myc的表达分别与MDM2和P53，及MDM2与P53之间的表达呈正相关，提示三者在原发性腹膜后脂肪肉瘤的发生、发展中可能起到协同作用。在以往关于脂肪肉瘤的研究中，有关于c-myc及MDM2分别与P53在脂肪肉瘤中的表达具有相关性的报道，从本组实验结果来看，c-myc与MDM2在脂肪肉瘤中的表达亦有相关性，所以不除外三者在原发性腹膜后脂肪肉瘤的发生、发展中起协同作用的可能性。 综上所述，恶性肿瘤发生往往是多步骤、多阶段的过程，通常是多个基因连续改变的不断累积的过程，常存在多个基因改变，有癌基因的异常激活及扩增，也有抑癌基因的失活及突变。原发性腹膜后脂肪肉瘤的恶性转化过程尚未完全阐明，但这方面研究已是近年来的热点。目前，在原发性腹膜后脂肪肉瘤诊断上，还没有找到有效的筛选方法，也缺乏单一确定的诊断方法。随着基因研究进展的发展，通过联合检测多种基因蛋白的表达，从而提高原发性腹膜后脂肪肉瘤的诊断水平，对了解原发性腹膜后脂肪肉瘤发生、发展的规律，并有效地控制及治疗原发性腹膜后脂肪肉瘤有重要意义。 第四章 结 论 4(1 c-myc、MDM2及P53在原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中表达均高于在脂肪瘤组织中的表达。 4(2 c-myc、MDM2及P53在分化较好的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括黏 液性和高分化)中的阳性率均低于分化较差的原发性腹膜后脂肪肉瘤类型(包括多形性、圆形细胞型及去分化型)中的阳性率，两者差别在统计学上有意义(P<0.05)。 4.3 c-myc、MDM2及P53蛋白在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达与患者的性别、年龄及肿瘤大小均无相关性(P>0.05)，三者在原发病例与复发病例之间的差别在统计学上均无意义(P>0.05)。 4(4 c-myc、MDM2及P53蛋白在原发性腹膜后脂肪肉瘤中的表达,两两之间具有统计学相关性(P<0.05)。