原料乳中抗生素的检测及其对酸乳发酵的影响

江西农业学报 2011，23( 2) : 144 ～ 146 Acta Agriculturae Jiangxi 原料乳中抗生素的检测及其对酸乳发酵的影响 华宝珍，杜昭平，马成杰 收稿日期:2010 －12 －10 基金项目:上海市科委农业成果转化资金( 083919n1500) 。 作者简介:华宝珍( 1972─) ，女，湖北武汉人，主要从事发酵乳制品的研究与开发工作。 ( 光明乳业技术中心 乳业生物技术国家重点试验室，上海 200436) 摘 要:研究了产酸抑制试验中嗜热链球菌不同菌株、保加利亚乳杆菌、混合发酵剂对青霉素的灵敏度，以及改变发酵剂 接种量对抗生素残留判断的影响，结果表明: 不同菌株对青霉素的敏感性存在一定差异，加大发酵剂接种量会导致对抗生素 残留检测结果的误判; 低浓度抗生素残留原料乳在使用直投式发酵剂时，抗生素残留对酸乳发酵时间、粘度、乳清析出、产品 口感等均有一定影响，因此，在生产上应避免由于抗生素检测误判造成的产品质量缺陷。 关键词:原料乳;发酵;抗生素;残留;检测 中图分类号: TS252． 54 文献标识码: A 文章编号: 1001 －8581( 2011) 02 －0144 －03 Detection of Antibiotic in Raw Milk and Its Effect on Yoghurt Fermentation HUA Bao － zhen，DU Zhao － ping，MA Cheng － jie ( State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technical Center of Bright Dairy ＆ Food Limited Company，Shanghai 200436，China) Abstract: The sensitivity of strains of Streptococcus thermophilus，Lactobacillus delbrueckii subsp． bulgaricus and mixed ferment to penicillin was studied，and the effect of change of inoculation amount of ferment to the judgment on antibiotic residue was also studied in this paper through acid inhibition test． The results indicated that there were differences in the sensitivity to penicillin among differ- ent strains，and the increase of the inoculation amount of the ferment could lead to the misjudgment on the result of antibiotic residue． Raw milk which had been misjudged as no residual antibiotic was fermented with direct vat set，and the results showed that the antibi- otic residue had influence on the fermentation time，viscosity，syneresis and mouth feeling． So the disfigurement of the product quality due to the misjudgment on antibiotic residue should be avoided in the production． Key words: Raw milk; Fermentation; Antibiotic; Residue; Detection 在奶牛的饲养过程中，由于受环境等因素的影响，奶 牛乳腺炎等疾病的发生率较高。但由于饲养企业较普遍 地使用抗生素治疗奶牛的细菌性感染，药物通过血液循 环系统进入乳房，进而导致牛乳中抗生素的残留。由于 抗生素能抑制嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌的 繁殖和产酸，酸乳、干酪等发酵乳制品的生产必须使用抗 生素残留检测合格的原料乳。 目前，国内外已有诸多抗生素残留检测的方法，如 以嗜热链球菌为指示菌的国标 TTC法［1］、以嗜热芽孢杆 菌为指示菌的 Delvotest － SP法［2］、基于抗生素分子中特 有基团特殊反应的高效液相色谱法和液相色谱─质谱联 用法等［3，4］，抗生素检测的灵敏度、准确性已大大提高。 但在实际生产中，抗生素残留检测是一项测定样品数量 多的常规检验工作，由于设备条件、检测费用、测定时间 等的限制，许多生产企业采用的检测方法是设备条件要 求不高、检测成本低、结果相对直观的发酵凝结试验法， 即在待检原料乳中添加酸奶发酵剂，在一定温度下发酵 一定时间后，以滴定酸度是否达到某一下限值来判定产 品的抗生素残留是否符合要求。 凝结试验虽在牛乳抗生素残留检测方面具有成本 低、结果直观、时间较短等优势，但国内在发酵剂菌株、接 种量等对抗生素测定结果的影响方面开展的研究工作不 多，在测定结果偏差对酸乳质量的影响等方面也鲜见报 道。本试验以常用的青霉素为例，研究了嗜热链球菌、保 加利亚乳杆菌的不同菌株、混合发酵剂对抗生素的灵敏 度，加大接种量对抗生素残留判定的影响以及低浓度抗 生素对酸乳质量的影响，以期提高凝结试验检测结果的 可靠性、准确性，避免抗生素残留对酸乳质量产生不良的 影响。 1 材料与方法 1． 1 试验材料与供试试剂 发酵剂:直投式酸奶发酵剂 T( 冷冻浓缩干燥菌粉，含单独的嗜热链球菌) ，购自丹麦 D公司;直投式酸奶发酵剂 Y( 冷冻浓缩干燥菌粉，含嗜 热链球菌、保加利亚乳杆菌) ，购自丹麦 H公司。 青霉素，市售 ( 华北制药集团动物保健品有限公 司) ; M17、MRS液体培养基，购自德国 Merck 公司，若配 制固体培养基则加入 10 g /L的琼脂，琼脂粉购于北京奥 博星公司;脱脂乳粉产自新西兰;白砂糖为市售;生牛乳 为武汉光明乳品公司提供的抗生素残留检测合格鲜 牛奶。 1． 2 主要仪器与设备 主要仪器与设备: APV1000 均质 机( 丹麦 APV公司) 、SA －300VF灭菌锅( 德国 Sturdy In- dustrial公司) 、GFL1002水浴锅( 德国 GFL 公司) 、FW30 搅拌器( 德国 FLUKO 公司) 、CA － 1480 － 3 超净工作台 (上海净化设备公司) 、Bactron －Ⅰ厌氧培养箱( 美国 Shel- lab公司) 、MIR －253 生化培养箱( 日本 SANYO 公司) 、 Orion868 pH计( 美国 ORION 公司) 、proRheo R180 粘度 计( 德国 proRheo公司) 。 1． 3 试验方法 1． 3． 1 菌株的分离纯化与发酵剂的制作 梯度稀释平 板法、42 ℃厌氧培养、MRS 培养基分离纯化发酵剂 Y中 的保加利亚乳杆菌( Lactobacillus bulgaricus) ，计为 Lb1。 MRS液体培养活化 2次后，在 11%还原的灭菌脱脂乳中 按起始菌数含量2 ×107 CFU/mL接种，42 ℃分别发酵6、 8、10、12 h，并用梯度稀释平板法、MRS 培养基计数其菌 数含量，选取菌株数含量高、处于对数生长末期的发酵剂 置于冰箱中保存备用。 梯度稀释平板法、39 ℃生化培养箱培养、M17 培养 基分别分离纯化在发酵剂 Y、发酵剂 T 中的嗜热链球菌 ( Streptococcus thermophilus) ，计为 St1、St2。M17 液体培 养活化 2次后，在 11%还原的灭菌脱脂乳中按起始菌数 含量 2 ×107 CFU/mL 接种，39 ℃分别发酵 4、6、8、10 h， 并用梯度稀释平板法、M17培养基计数其菌数含量，选取 菌数含量高、处于对数生长末期的发酵剂置于冰箱中保 存备用。 1． 3． 2 不同菌株与发酵剂对抗生素灵敏度的测定 将 160万 IU的粉末状青霉素先溶解于 100 mL 无菌蒸馏 水，细菌过滤器除菌过滤后，用灭菌蒸馏水稀释至适当浓 度梯度备用。脱脂乳粉按 11%还原、40 mL /管分装于 30 只 200 mm ×25 mm带盖试管中，95 ℃水浴杀菌 10 min， 水浴冷却至 42 ℃后分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ共 6 组，再分别 加入不同稀释度的青霉素，使青霉素的终浓度为 0、 0． 01、0． 02、0． 04、0． 08、0． 16 IU /mL，然后在上述各浓度 青霉素脱脂乳中分别加入 St1、St2、Lb1、St1 + Lb1、St2 + Lb1发酵剂，起始总接种量的菌数含量均为 2 ×107 CFU/ mL，其中混合发酵剂球杆菌比例以菌数含量计为 1∶ 1，具 体见表 1。3 h后每隔 15 min测定 1次Ⅰ组( 对照组，可备 5 ～10个重复，便于适时测定滴定酸度等) 的滴定酸度或 pH值，至发酵终点酸度 75 °T 时记录发酵时间，并同时 测定该菌种组其他不同浓度青霉素样品的酸度或 pH 值，以 ΔpH值大于 0． 2或酸度大于 5 °T为差异显著。 滴定酸度:取 10 g酸乳，加入到 20 mL蒸馏水中，同 时滴加0． 5%酚酞2 mL，以0． 1 mol /L的NaOH滴定至粉 红色，滴定体积( mL) 乘以 10即为该酸乳的滴定酸度值， 用吉尔涅尔度( °T) 表示［5］。 1． 3． 3 接种量对抗生素检测结果的测定 脱脂乳粉按 11%还原、40 mL /管分装于 30 只 200 mm × 25 mm 带盖 试管中，95 ℃水浴杀菌 10 min，水浴冷却至 42 ℃后分为 Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ共 6 组，分别加入不同稀释度的青霉 素使终浓度为 0、0． 01、0． 02、0． 04、0． 08、0． 16 IU /mL的青 霉素。在上述各不同浓度青霉素脱脂乳中分别加入 St1 ( 2 ×107 CFU/mL) 、St1 ( 4 × 107 CFU/mL) 、St1 ( 8 × 107 CFU/mL) 、St1 + Lb1 ( 2 × 107 CFU/mL) 、St1 + Lb1 ( 4 × 107 CFU/mL) 、St1 + Lb1( 8 ×107 CFU/mL) 等 6组不同菌 种或菌种添加量的发酵剂，混合发酵剂球杆菌比例以菌 数含量计为 1∶ 1，具体见表 2。3 h 后每隔 15 min 测定 1 次Ⅶ组( 对照组，可备 5 ～ 10 个重复，便于适时测定滴定 酸度等) 的滴定酸度或 pH值，至发酵终点酸度 75 °T 时 记录发酵时间，并同时测定本菌种组其他不同浓度青霉 素样品的酸度或 pH值，以 ΔpH值大于 0． 2 或酸度大于 5 °T为差异显著。 表 1 菌种组合方式 编号 菌种组合 类型 球杆菌比 A St1 单菌株 / B St2 单菌株 / C Lb1 单菌株 / D St1 + Lb1 混合发酵剂 1∶ 1 E St2 + Lb1 混合发酵剂 1∶ 1 注:起始总接种量均为 2 ×107 CFU /mL。 表 2 发酵剂及其接种量组合方式 编号 菌种组合 起始总接种量( CFU/mL) 类型 球杆菌比 F St1 2 ×107 单菌株 / G St1 4 ×107 单菌株 / H St1 8 ×107 单菌株 / I St1 + Lb1 2 ×107 混合菌株 1∶ 1 J St1 + Lb1 4 ×107 混合菌株 1∶ 1 K St1 + Lb1 8 ×107 混合菌株 1∶ 1 1． 3． 4 低浓度抗生素对酸乳质量的测定 生牛乳经配 料( 添加 8%的白砂糖) 、均质、杀菌、冷却后，分装至 1000 mL搪瓷缸中，分别添加不同浓度的 0． 02、0． 04、0． 08 IU / mL的青霉素和 0． 2 U /1000 mL的直投式发酵剂 Y，以只 添加发酵剂 Y、不添加青霉素为对照。样品置于 42 ℃生 化培养箱中发酵，适时测定酸度至 75 °T后终止发酵，经 冰水浴冷却 60 min，用 FW30 搅拌器转速 5、搅拌 5 min 后，置于 6 ℃冰箱冷藏 24 h 后测定产品的粘度，并进行 口感测评与感官评价，感官评价以质地、口感、粘度、风 味、酸甜比、外观等为主要评价指标进行评价［6］，评价标 准见表 3。 表 3 酸奶感观评价指标 项目 评价标准 质地 无凝块、均匀、无颗粒 口感 细腻、滑爽、无沙质感、无粗糙感 粘度 粘度良好、口感厚实 风味 酸奶特征风味明显、无异味 5412 期 华宝珍等:原料乳中抗生素的检测及其对酸乳发酵的影响 2 结果与分析 2． 1 发酵剂的制备 St1嗜热链球菌、St2嗜热链球菌均 以 39 ℃发酵 6 h的菌数含量最高，Lb1 保加利亚乳杆菌 在 42 ℃发酵 10 h的菌数含量最高。不同菌株发酵剂制 作最适发酵时间、发酵剂菌数含量见表 4。 表 4 发酵剂的最适发酵时间及菌数含量 菌种组合 发酵时间( h) 菌数含量( CFU/g) St1 6 1． 9 ×109 St2 6 2． 3 ×109 Lb1 10 7． 2 ×108 2． 2 不同菌株与发酵剂对青霉素检测灵敏度的影响 不同菌株或发酵剂以相同起始浓度的接种量接入到添加 了不同浓度青霉素的牛奶中，不添加青霉素的对照组滴 定酸度至 75 °T时的发酵时间、滴定酸度见表 5，以滴定 酸度相差大于 5 °T 为差异显著，不同单菌株、混合发酵 剂对青霉素的敏感度有一定差异。嗜热链球菌中 St1 菌 株较 St2菌株敏感，嗜热链球菌较保加利亚乳杆菌敏感， 混合发酵剂较单一菌株敏感度低。 抗生素残留检测的国家标准 GB 4789． 27 中［1］应用 的是 TTC法，指示菌为嗜热链球菌，试验结果表明:不同 的嗜热链球菌菌株对抗生素的敏感程度有一定差异，使 用抗生素敏感程度低的嗜热链球菌进行检测可能会对实 际生产带来一定的影响。同时，在实际操作中，由于诸多 乳品生产企业使用的是混合发酵剂发酵凝结试验来判定 原料奶抗生素残留，其敏感程度更低，可能给实际生产带 来更大的影响。 表 5 菌株与发酵剂对抗生素检测结果的影响 编号 处理 Ⅰ( 对照) Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 发酵时间 ( h) 抗生素敏感 浓度( IU /mL) A 75 75 67 57 32 28 6． 0 0． 02 B 75 76 73 61 34 19 6． 0 0． 04 C 75 74 72 63 38 24 10． 0 0． 04 D 75 77 72 61 49 32 5． 5 0． 04 E 75 76 76 74 54 28 5． 5 0． 08 2． 3 接种量对抗生素检测的影响 同一菌株或发酵剂 以不同起始浓度的接种量接入到添加了不同浓度青霉素 的牛奶中，不添加青霉素的对照组滴定酸度至 75 °T 时 的发酵时间、不同处理的滴定酸度见表 6，以滴定酸度大 于 5 °T为差异显著，同一菌株或发酵剂不同接种量对青 霉素的敏感度有一定差异，接种量越高，则对青霉素敏感 度越低。郭本恒［7］认为添加较大量的发酵剂，可使许多 微生物细胞吸收抗生素，而另一些剩余微生物能产酸和 产香，因此加大接种量使一些抗生素残留较高的原料乳 发酵产酸正常，发酵凝结试验将其判定为无抗。 在实际操作中，乳品生产企业在应用凝结试验判断 原料奶的有抗或无抗时往往使用的是混合发酵剂，且对 其接种量没有非常严格的规定，这就存在将一些抗生素 残留量比较高的原料奶误判为无抗奶。而在实际生产 中，使用的直投式发酵剂由于成本较高等原因而没有相 应提高其接种量，这导致在低浓度抗生素残留牛奶检测 中的误判可能会对酸乳发酵时间、产品品质产生较大的 影响。 表 6 发酵剂及其接种量对抗生素检测结果的影响 编号 起始总接种量( CFU/mL) 处理 Ⅶ( 对照) Ⅷ Ⅸ Ⅹ Ⅺ Ⅻ 发酵时间 ( h) 抗生素敏感浓度 ( IU /mL) F 2 ×107 75 75 67 57 32 28 6． 0 0． 02 G 4 ×107 75 76 74 61 34 29 5． 5 0． 04 H 8 ×107 75 77 73 67 34 31 5． 0 0． 04 I 2 ×107 75 77 72 61 49 32 5． 5 0． 04 J 4 ×107 75 76 76 75 64 41 4． 5 0． 08 K 8 ×107 75 75 77 76 74 53 4． 0 0． 16 2． 4 低浓度抗生素对酸乳质量的影响 在原料乳中加 入较低浓度、以 8 ×107 CFU/mL 的接种量认为是无抗生 素残留的青霉素，接入直投式发酵剂 Y，发酵剂添加量按 200 U / t，测定产品达到 75 °T滴定酸度所用的时间、产品 粘度、口感风味评价、产品球杆菌比例等。 从表 7可以看出，0． 04 ～ 0． 08 IU /mL 的青霉素浓度 虽在有抗或无抗检测时，在接种量较大的情况下被判定 为无抗生素残留，但在实际生产过程中使用直投式发酵 剂 Y时，其对产品发酵时间、粘度、口感等均有一定影 响。因此，抗生素残留于乳中时首先抑制嗜热链球菌的 生长繁殖，并破坏嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的共生关 系，导致产品发酵产酸迟缓、粘度降低、乳清析出增多。 表 7 低浓度抗生素对酸乳发酵及其质量的影响 编号 发酵时间( h) 粘度 感官评价 1( 对照) 5． 50 0． 342 口感细腻滑爽、粘度良好、 几乎无乳清析出 2( 0． 02 IU /mL) 5． 67 0． 338 口感细腻滑爽、粘度较好、 几乎无乳清析出 3( 0． 04 IU /mL) 6． 50 0． 301 口感较为粗糙、粘度较差、 少量乳清析出 4( 0． 08 IU /mL) 8． 30 0． 263 口感粗糙、粘度差、 较多乳清析出 3 小结与讨论 嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的不同菌株、混合发 ( 下转第 149页) 641 江 西 农 业 学 报 23 卷 图 1 温度和 pH交互影响稀释率的曲面图及等高线图(长径比 =4． 00) 3 讨论 本文采用中心组合试验，以牛奶连续接种 稀释率为指标，探讨了牛奶连续接种各参数确定的新方 法。通过各指标的回归模型的建立，各组分间的交互作 用分析，结合软件的优化功能，表明中心组合设计可有效 地应用于牛奶连续接种各参数优化，这种方法可减少实 验数量，提高设计的准确性。 4 结论 用中心组合设计对牛奶连续接种各参数进行优化， 获得了牛奶连续接种的最优参数组合为连续接种温度 40． 9 ℃、pH 6． 8、长径比 4． 8。 本实验采用的中心组合设计通过建立试验指标与 各组分的回归模型，考查牛奶连续接种各参数中的互作 效应，并通过模型优化得到了牛奶连续接种各参数的最 优组合，这种方法不仅科学合理，而且快速有效。 参考文献: ［1］许本发． 酸奶和乳酸菌饮料加工［M］． 北京: 中国轻工出版 社，1994． ［2］梁勇．浓缩乳酸菌发酵剂的制备［J］．中国乳品工业，1995，23 ( 3) : 132 ～134． ［3］黄良昌．酸奶发酵剂的研究进展［J］．广州食品工业科技，2001 ( 3) : 43 ～46． ［4］de Man，J． C． A medium for the cultivation of lactobacilli［J］． Journal of Applied Bacteriology，1960，23( 1) : 130 －135． ［5］周剑忠．藏灵菇微生物分子生态分析及微囊化发酵剂的研究 ［D］．南京:南京农业大学，2005． ［6］GB/T 16347 － 1996． 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验 ［S］． ［7］汪仁官． 实验设计［M］． 陈荣昭译． 北京: 中国统计出版 社，1998． ［8］洪南，侯军． SAS for Windows ( V8) 统计分析系统教程新编 ［M］．北京: 清华大学出版社， 櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗 2004． (上接第 146页) 酵剂对抗生素的灵敏度有一定的差异，选择对抗生素灵 敏度高的嗜热链球菌菌株进行原料乳抗生素残留检测 有助于保证结果的可靠性、准确性。加大接种量会使发 酵剂对抗生素敏感度更低，从而导致抗生素残留较高的 原料乳被误判为无抗奶。低浓度抗生素残留原料乳在 使用直投式发酵剂时，抗生素残留对其发酵时间、产品 口感、粘度、乳清析出等均有一定影响，因此，在生产上应 避免加大接种量进行抗生素检测而导致的产品质量 缺陷。 参考文献: ［1］GB/T 4789． 27─2008，食品卫生微生物学检验———鲜乳中抗 生素残留检验［S］．北京:中国标准出版社，2008． ［2］马兆瑞，祝战斌，卡尔·莱金特．乳和乳制品中残留抗生素的 检测方法［J］．中国乳品工业，2003，31( 4) : 37 ～40． ［3］彭莉，岳秀英．高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留量 ［J］．中国兽药杂志，2003，15( 1) 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