ELISA法检测干扰素[整理]

ELISA法检测干扰素[整理] ELISA法检测干扰素 干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，仅在同种细胞上发挥作用。根据其来源、理化及生物学性质的不同，可分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ3种干扰素。其中，IFN-α主要由白细胞产生，IFN-β由成纤维细胞产生，IFN-γ主要由T细胞在免疫应答中受到抗原或丝裂原活化后分泌产生。3种干扰素中，IFN-α、IFN-β抗病毒作用较强，IFN-丁免疫调节作用较强。目前已可用基因重组技术制备干扰素投入临床使用。干扰素不能直接灭活病毒，其抗病毒作用是由于它能激活细胞内抗病毒蛋白基因，制造抗病毒蛋白，抑制病毒在体内复制。干扰素不仅可抑制已感染细胞内病毒的复制，而且还可使未感染细胞处于抗病毒状态，对中断病毒的细胞间传播有一定作用;但对病毒整合基因可能仅有暂时抑制其mRNA的转录作用，不能清除病毒基因。干扰素的免疫调节作用表现为它是重要的巨噬细胞活化因子(macro-phageactivating factor，MAF)，活化的巨噬细胞能杀死病原微生物或杀伤肿瘤细胞。干扰素能增强各种细胞表达MAF分子从而有利于递呈抗原或利于T细胞对靶细胞的识别和杀伤;还能促进T、B细胞的分化，活化NK细胞和中性粒细胞，从而有助于加强免疫应答。由于干扰素不是一种淋巴细胞的生长因子，故常抑制淋巴细胞(特别是B细胞)的增殖。 IFN抗病毒活性的特点如下:?仅仅是抑制作用，IFN消失后病毒将重新复制，因此必须足量反复应用;?有相对的种属特异性，IFN-γ较IFN-α、IFN-β严格;?IFN不直接灭活病毒，而是通过细胞基因组产生另一些蛋白因子来发挥效能，因此不同细胞对IFN的敏感性不同;?不同感染状态的病毒-细胞系统对IFN的敏感性不同，病毒大量复制、引起细胞炎症应答时，IFN易产生效应;对完整细胞中的整合型病毒无作用。 [检测方法] ELISA法 [方法学原理] 抗人IFN抗体包被在微孔反应板上，待测标本和品中的IFN会与抗人IFN抗体结合， 游离的成分被洗去，同时加入生物素化的抗人IFN抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异结合，抗人IFN抗体与结合在单克隆抗体上的人IFN结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IFN，HRP会使五色的显色剂呈现蓝色，加终止液变黄色。在波长450nm处测吸光度，IFN浓度与吸光度成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的IFN浓度。 [标本准备] 静脉血2ml，不抗凝。 [试剂) 1(预包被微孔反应板 2(浓缩酶结合物 3(酶结合物稀释液 4(标准晶和标本稀释液 5(浓缩生物素化抗体 6(TFN标准品 7(浓缩洗涤液 8.显色剂A、B 9(终止液 [仪器] 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。 [检测步骤] 1(在微孔反应板相应孔中分别加入待测样本、不同浓度标准品100ul，再加生物素化抗体工作液50ul。 2(振荡混匀，置20,25?环境中温育120min。 3(将孔内液体吸干，用洗涤液充分洗涤5次，干燥。 4(除空白孔外，加入酶结合物工作液100u1。 5(振荡混匀，置20,25?环境中温育30min。 6(将孔内液体吸干，用洗涤液充分洗涤5次，干燥。 7(每孔加入显色剂A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37?环境中避光显色10min。 8(加入终止液50gl后，轻轻振荡混匀。用酶标仪(450nm波长)测定各孔吸光度，与标准曲线对照，求出IFN值。 [正常参考值] 各实验室可根据检测方法的不同确立正常参考值。 [注意事项] 1(试剂盒从冷藏环境中取出时应在室温环境中平衡30min后方可使用，来用完的微孔条用自封袋密封保存。 2(酶标板洗涤时各孔均需加满洗涤液，防止孔内有游离酶不能洗净。应设定30-60s的洗涤浸泡时间。 3。滴加试剂前应将滴瓶翻转数次，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。 4.所有样品和废弃物都应按传染源处理。终止液为2mol,L硫酸，使用时应注意安全 5.每批样本应同时做标准曲线。 6.检测剂工作液按说明书临用前配置。 7.若标本OD值在标准曲线测定范围以外，应适当稀释后重测。 [临床意义] IFN水平的改变主要见于自身免疫性疾病;在感染性疾病中，升高见于急性病毒感染，降低见于乙型肝炎病毒携带者、其他慢性病毒性肝炎及AIDS患者。